SHP-2酪氨酸磷酸酶C-SH2結(jié)構(gòu)域的表達(dá)純化和NMR研究.pdf

1、SHP-2是一種去磷酸化的非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及調(diào)控細(xì)胞活性中具有重要作用。其突變體與多種惡性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，因此SHP-2很可能為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 為更好地研究該酶的結(jié)構(gòu)與功能，通過(guò)PCR方法從SHP-2(GenBank登錄號(hào)為L(zhǎng)03535)中擴(kuò)增出C-SH2結(jié)構(gòu)域的完整ORF序列，并命名為C-SH2。該基因序列長(zhǎng)為31.bp，編碼105個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為11

2、.71.kD。將擴(kuò)增的C-SH2基因克隆到融合表達(dá)載體pGEX-2T相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上，得到融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T-C-SH2，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序證明重組質(zhì)粒是正確的。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)并在LB培養(yǎng)基中表達(dá)，用終濃度為0 mM的IPTG在37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，裂解菌體作SDS-PAGE分析，在3.kD左右的位置出現(xiàn)特異性蛋白條帶，與預(yù)期值(融合標(biāo)簽2.kD，C-SH2蛋白11.71.kD)相符。用

3、超聲裂解菌體后，該融合蛋白主要存在于上清液中，上清用GST親和層析柱進(jìn)行吸附和柱上凝血酶22℃酶切16小時(shí)后，獲得目的蛋白C-SH2，純度達(dá)90％以上。C-SH2蛋白在兩端融合有載體pGEX-2T自身表達(dá)的一段17個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)融合蛋白分子量為13.55.kD，等電點(diǎn)為6.66，但是蛋白結(jié)構(gòu)沒(méi)有發(fā)生改變。經(jīng)FPLC進(jìn)一步純化后，純度達(dá)98％以上。質(zhì)譜分析表明該融合蛋白的分子量為13.51.kD，與預(yù)測(cè)值13.55.kD一致，證實(shí)該蛋白表