2-DG通過(guò)下調(diào)RIP1增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的敏感性.pdf

1、目的：⑴研究糖基化抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。⑵研究2-DG對(duì)腫瘤壞死因子誘導(dǎo)配體（tumors necrosis factor-related apotosis-inducing ligand，TRAIL）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)作用。⑶探討2-DG對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典蛋白GRP78及凋亡抑制蛋白IAPs表達(dá)的影響。⑷探討2-DG對(duì)受體相互作用蛋白R(shí)IP1表達(dá)的影響

2、及下調(diào)RIP1后對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：①M(fèi)TT法檢測(cè)不同濃度2-DG（1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1）及與TRAIL（200 ng·ml-1）合用處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及MDA-MB-43524、48、72 h后對(duì)細(xì)胞存活率的影響。②溴化丙啶（propidium iodide，PI）單染法檢測(cè)2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1）對(duì)人

3、乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響。③Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的影響。④利用線粒體膜電位檢測(cè)（JC-1）試劑盒檢測(cè)2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1）對(duì)人乳腺癌細(xì)胞早期凋亡的影響。⑤Western blotting法檢測(cè)2-DG（10 mmol·L-1）與TRAIL（200 ng·ml-1

4、）處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MDA-MB-435對(duì)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Caspase-8，凋亡抑制蛋白cIAP1、XIAP，受體相互作用蛋白R(shí)IP1以及原型抑制因子IkBα表達(dá)的影響。⑥利用siRNA下調(diào)RIP1后，PI單染法檢測(cè)對(duì)TRAIL(200 ng·ml-1)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：⑴MTT法結(jié)果顯示不同濃度2-DG（0、1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1）對(duì)人乳腺癌細(xì)

5、胞MDA-MB-231及MDA-MB-435有增殖抑制作用，且隨著2-DG濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231及MDA-MB-435增殖抑制作也不斷增強(qiáng)。10 mmol·L-12-DG作用于人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的24、48、72 h細(xì)胞存活率分別為84.96％、60.63%、53.39%和78.16%、53.94%、50.15%。當(dāng)不同濃度2-DG與TRAIL（200 ng·

6、ml-1）聯(lián)合作用于細(xì)胞時(shí)，隨著2-DG濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率與單用2-DG相比明顯降低。⑵10 mmol· L-12-DG、200 ng· ml-1 TRAIL以及合用組處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-43524 h，PI單染法檢測(cè)結(jié)果顯示：10 mmol· L-12-DG單用組誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的24 h凋亡率分別為5.0%和3.8%，與陰性對(duì)照組相比比較

7、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，200 ng· ml-1 TRAIL作用24 h誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435的凋亡率分別為24.0%和22.3%，兩者合用后，凋亡率達(dá)到34.0%和36.1%。Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果與單染法所得結(jié)果一致。⑶實(shí)驗(yàn)中采用10 mmol·L-12-DG、200 ng·ml-1 TRAIL以及合用組處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-43524 h，JC-1檢測(cè)

8、結(jié)果顯示：?jiǎn)斡媒M沒(méi)有觀察到紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變，合用組紅色熒光向綠色熒光轉(zhuǎn)變較明顯。⑷Western blotting結(jié)果顯示：空白對(duì)照組、10 mmol·L-12-DG單用組中沒(méi)有Caspase-3、Caspase-8的激活， TRAIL單用組與對(duì)照組相比有一定的Caspase-3、Caspase-8得激活，二者合用后，Caspase-3、Caspase-8的激活明顯增加（圖6）。且隨著2-DG作用時(shí)間的延長(zhǎng)，GRP78及TRAIL

9、-R2的表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖7），cIAP1、XIAP及RIP1的表達(dá)都逐漸減弱。⑸siRNA預(yù)處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-43524 h后，western boltting法檢測(cè)RIP1表達(dá)明顯降低。采用同樣方法，siRNA預(yù)處理細(xì)胞24 h后，采用10 mmol·L-12-DG、200 ng·ml-1 TRAIL處理細(xì)胞24 h，PI單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比， siRNA預(yù)處理后，合用組細(xì)胞

10、的凋亡率明顯增加。⑹Western boltting法檢測(cè)原型抑制因子IκBα的變化，結(jié)果顯示：采用10 mmol· L-12-DG處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435，隨著2-DG作用時(shí)間的延長(zhǎng)，原型抑制因子IkBα表達(dá)逐漸減弱。
　　結(jié)論：①2-DG對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-435具有增殖抑制作用，且隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低，但細(xì)胞對(duì)2-DG誘導(dǎo)的凋亡不敏