rhTWEAK在乳腺癌中對TRAF2誘導(dǎo)作用的研究.pdf

1、腫瘤壞死因子樣微弱誘導(dǎo)劑(TNF-like weak inducer of apoptosis，Tweak)是TNF配體家族成員之一，為Ⅱ型跨膜蛋白，主要與細胞表面的TNF受體家族成員-Fn14(fibroblast growth factor inducible14)結(jié)合形成信號復(fù)合物來發(fā)揮廣泛的生物學(xué)活性，如:介導(dǎo)細胞凋亡、誘導(dǎo)細胞的分化、增殖、移行和粘附，還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和血管形成。而目前發(fā)現(xiàn)的7種腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(T

2、umornecrosis factor receptor-associated factors，TRAFs)家族成員(TRAF1-7)，作為一類重要的細胞銜接蛋白，能夠與多種細胞表面受體的胞漿部分結(jié)合，參與多個細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，包括NF-kB和JNK通路的活化．這7種成員盡管都含有TRAF同源結(jié)構(gòu)域，但是在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中所起到的作用卻不盡相同，其中以TRAF2最為重要。目前，國內(nèi)外研究認為，在細胞系中外源性轉(zhuǎn)染TRAF2使之過表

3、達可促進NF-kB活化。 本實驗主要利用免疫熒光檢測幾種不同乳腺癌細胞系中Fn14的表達情況，利用Western Blot和免疫共沉淀檢測在rhTWEAK(重組人TWEAK)刺激下幾種乳腺癌細胞系中TRAF2表達改變的情況，以及經(jīng)過rhTWEAK刺激之后是否發(fā)生了NF-kB信號通路的活化。 材料與方法： 一、材料 正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，人雌激素受體非依賴性乳腺癌細胞系MDA-MB-231和MD

4、A-MB-435s。 二、主要試劑和來源 羊抗人多克隆anti-Fn14抗體(sc-27141)、鼠抗人單克隆anti-TRAF1抗體(se-6253)鼠抗人單克隆anti-TRAF2抗體(sc-7346)均購自美國Santa Cruz公司。鼠抗人單克隆anti-Phospho-IκBα抗體(＃9246)購自Cell signaling公司。人重組TWEAK(rhTWEAK)(＃310-06)購自Peprotech公司。

5、DAB酶底物顯色試劑盒(ZLI-9032)和辣根酶標記第二抗體(ZB-2301)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫共沉淀相關(guān)μColumns(Order No.130-042-701)和μMACS Protein GMicroBeads(Order No.130-071-101)購自德國Miltenyi Biotec公司。DMEM高糖、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司。胰酶(Order No.27250018)購自

6、美國Invitrogen公司。Western blot及IP細胞裂解液(Order No.P0013)購自碧云天生物技術(shù)研究所。 三、方法 1、應(yīng)用免疫熒光方法檢測Fnl4在培養(yǎng)的正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s中的表達。 2、應(yīng)用Western blot方法檢測培養(yǎng)的正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435

7、s經(jīng)rhTWEAK刺激之后，TRAF2表達改變的情況。 3、應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測培養(yǎng)的正常乳腺上皮細胞系MCF-10A，乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s經(jīng)rhTWEAK刺激之后，與TRAF1結(jié)合狀態(tài)的TRAF2表達改變的情況． 4、應(yīng)用Western blot方法檢測培養(yǎng)的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s經(jīng)rhTWEAK刺激之后NF-κB信號通路的活化情況。 5、

8、應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計分析軟件，對TRAF2在各細胞系中的表達量以及TRAF2與TRAF1在各細胞系中的結(jié)合量進行方差分析及其兩兩t檢驗，p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，p<0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、免疫熒光方法檢測Fn14在正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌細胞系中的表達 (1)Fn14在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中陽性表達。 (2)Fn14在正常乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系M

9、DA-MB-435s中不表達。 2、Western blot方法檢測 經(jīng)rhTWEAK刺激之后TRAF2在正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌不同轉(zhuǎn)移性細胞系中的表達。 (1)以不同濃度的rhTWEAK與三株細胞系分別孵育24h后收集細胞，經(jīng)Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)n14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中TRAF2呈濃度依賴性表達上調(diào)(P<0.01)，而Fn14陰性表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-

10、435s中TRAF2則也呈濃度依賴性表達上調(diào)(P<0.01)。 (2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株細胞系分別孵育，按照設(shè)計的時間點收集細胞，經(jīng)Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)n14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中TRAF2呈時間依賴性表達上調(diào)(P<0.01)，而Fn14陰性表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF2也則呈時間依賴性表達上調(diào)(P<0.01)。 3、免疫共沉淀檢測

11、 經(jīng)rhTWEAK刺激之后TRAF2和TRAF1在正常乳腺上皮細胞系及乳腺癌不同轉(zhuǎn)移性細胞系中的結(jié)合情況。 (1)TRAF2與TRAF1在MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-435s三種細胞系中均結(jié)合。 (2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株細胞系分別孵育24h后收集細胞，與TRAF1結(jié)合的TRAF2在Fn14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中表達明顯上調(diào)(P<0.01)，而在Fn14陰性

12、表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中表達下調(diào)(P<0.05)。 4、Western blot方法檢測 乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s經(jīng)rhTWEAK刺激之后NF-kB信號通路的活化情況。 (1)在MDA-MB-231中，經(jīng)rhTWEAK刺激之后發(fā)生了短暫(15-30min)的I-kBα的磷酸化。 (2)在MDA-MB-435s中則沒有發(fā)生-過性的I-κBα的磷酸化

13、。 結(jié)論： 1、Fn14在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中陽性表達，在正常乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MDA-MB-435s中不表達。 2、rhTWEAK對TRAF2的誘導(dǎo)作用表現(xiàn)為在Fn14陽性表達的細胞系MDA-MB-231中呈濃度和時間依賴性上調(diào)，而在Fn14陰性表達的細胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中也呈濃度和時間依賴性上調(diào)。 3、rhTWEAK可以誘導(dǎo)Fn14陽性表達