低劑量輻射(LDR)對DNA-PKcs基因沉默人乳腺上皮細胞DNA修復相關蛋白表達的影響.pdf

1、乳腺癌通常指發(fā)生在乳房腺上皮組織的惡性腫瘤。全世界每年患乳腺癌的婦女多達120萬人，且發(fā)病率以每年0.2％～8％的速度上升。在美國，乳腺癌一直處于女性癌癥的第一位，而我國乳腺癌的發(fā)病率也有逐年增高趨勢，現已位于女性癌癥第二位，僅次于子宮癌，是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤。
　　 目前，乳腺癌主要采用手術治療、化學藥物治療(簡稱化療，Chemotherapy)和放射治療(簡稱放療，Radiotherapy

2、)等綜合治療體系。放療作為乳腺癌治療最為有效的手段之一，可減少復發(fā)率和死亡率，在乳腺癌治療中起到了十分重要的作用。但是，放療在最大限度地控制腫瘤的同時也會對周圍正常組織產生放射旁效應(放療的副作用)。放射旁效應主要是指，在對癌細胞DNA作為靶點輻射時，對周圍正常細胞DNA造成損傷的效應，即由低劑量放射(low dose radiation，LDR)所引起的DNA雙鏈斷裂(dodble-strand breaks，DSBs)。靶點周圍正常

3、細胞對DSBs的修復是降低放療副作用的最佳途徑，因此，研究低劑量輻射的DNA修復機制具有重要的意義。
　　 細胞對DSBs損傷的修復方式主要有兩種：以DNA依賴蛋白激酶(DNA-dependentprotein kinase，DNA-PK)為主的非同源性末端連接(Nonhomologous end-ioinin，NHEJ)修復和以ATM為主的同源重組(Homologous recombination，HR)修復。ATM(atax

4、ia-telangiectasia-mutanted)蛋白激酶是HR修復修通路的關鍵蛋白，它是毛細血管擴張性共濟失調癥突變基因(atm)編碼的一種磷酸化的大分子核磷蛋白，分子量約為350kD。ATM作為P53的重要調節(jié)物質，主要功能是參與細胞周期的調控、DNA損傷識別和修復。盡管ATM介導的HR修復通路可恢復DNA鏈的連續(xù)性，但在哺乳動物細胞DSBs修復過程中，NHEJ途徑起主要作用。
　　 NHEJ修復途徑主要依賴4個核心因子

5、：DNA-PK、XRCC4、DNA連接酶IV和Artemis。其中DNA-PK包含一個具有絲/蘇氨酸激酶活性的催化亞基DNA-PKcs和兩個能啟動NHEJ修復的Ku亞基。DNA-PKcs是一個重要的損傷修復蛋白，除在NHEJ、VDJ重組和維持端粒結構中起關鍵作用外，還可磷酸化諸多轉錄因子和修復因子。近年來研究發(fā)現，DNA-PK表達缺失或下調不僅表現出DSBs修復障礙，還可使細胞對低劑量的電離輻射的敏感性增加，提示它在細胞對LDR進行應答

6、中起到重要的作用，與一些腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系，其作用機制是近年來國際關注的熱點。
　　 本研究模擬乳腺放療中的放射旁效應，以人乳腺上皮細胞系(MCF10)為對象，首先研究了低劑量輻射對細胞生長和增殖的影響；然后，檢測了不同的DNA損傷修復信號通路(HR和NHEJ通路)、增殖信號通路(MAPK/ERK通路)以及生存信號通路(PI3K/AKT通路)中主要信號蛋白表達的變化，確定低劑量輻射的信號分子效應；進一步利用siRNA干

7、擾技術沉默人乳腺細胞DNA-PKcs基因，觀察了DNA-PKcs基因沉默細胞對LDR的敏感性以及DSBs修復相關蛋白表達水平的影響，探討了人乳腺上皮細胞對LDR敏感性變化的可能機制以及DNA-PKcs的作用，旨在了解正常人乳腺上皮細胞對LDR造成細胞DSBs后的反應以及DNA修復的機制。實驗主要分為兩部分：
　　 (一)LDR對人乳腺上皮細胞DNA修復相關蛋白表達的影響
　　 用50cGy和100cGy照射人乳腺上皮細胞

8、，MTT法觀察LDR對乳腺細胞增殖以及倍增時間的影響以檢測細胞對LDR的敏感性變化，Western blot檢測了LDR誘導的不同時間點(2小時、12小時和24小時)DNA-PKcs和ATM介導的DNA修復通路、MAPK介導的增殖通路、PI3K/AKT介導的生存通路以及Cav-1和NF-kB等相關蛋白表達水平。
　　 結果表明：(1)50cGy和100cGy照射后，細胞增殖均受到抑制，100cGy的抑制作用明顯，提示，乳腺細胞對

9、LDR的敏感性具有劑量依賴性。(2)100cGyγ射線輻射可引起乳腺細胞內ATM、P53、DNA-PKcs等DNA修復相關蛋白表達明顯增加，提示低劑量引起DNA-DSBs的修復既可以通過HR，也可以通過NHEJ通路完成。(3)100cGyγ射線輻射可引起乳腺細胞MAPK、AKT蛋白活性增強，轉錄因子NF-kB和乳腺癌抑癌基因Cav-1表達增加，提示LDR對乳腺細胞的效應與Cav-1介導的增殖和存活通路與DNA修復通路的共同作用有關。

10、r>　　 結論：LDR能夠引起人乳腺上皮細胞DNA損傷，增加細胞的輻射敏感性，其修復機制是HR和NHEJ通路被激活，細胞增殖和存活相關蛋白也參與LDR引起的損傷修復和調節(jié)。
　　 (二)LDR對DNA-PKcs基因沉默的乳腺上皮細胞DNA修復相關蛋白表達的影響
　　 利用siRNA干擾技術使人乳腺上皮細胞DNA-PKcs基因沉默，用50cGy和100cGy照射細胞，MII法觀察LDR對乳腺細胞增殖的影響，Western

11、 blot檢測DNA修復相關蛋白ATM、Ku80和P53等表達的變化。
　　 結果表明：(1)成功地建立了DNA-PKcs基因沉默細胞模型(MCF10pk)，DNA-PKcs基因表達比對照下調90％；(2)DNA-PKcs基因沉默細胞MCF10pk對100cGy LDR輻射敏感度增大，細胞生長減慢；(3)LDR均可使MCF10細胞P53蛋白、Ku80等DNA修復相關蛋白表達增多，但DNA-PKcs基因沉默細胞MCF10pk中的蛋