PDX-1真核表達載體構建及其在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達.pdf

1、背景和目的：
　　 目前，糖尿病的治療方法不能使所有糖尿病患者血糖理想控制，胰島細胞移植治療糖尿病引起國內外學者的關注，但異體胰島細胞移植由于胰島細胞來源不足和免疫排斥反應等問題限制了其臨床應用。
　　 骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潛能的一類非造血干細胞，可以分化為內胚層的細胞如胰島樣細胞和脂肪細胞等[1-3]

2、。MSCs取材方便、易于分離培養(yǎng)，體外擴增能力強，遺傳性能穩(wěn)定，易于轉染和穩(wěn)定表達外源基因，避免免疫排斥反應，且不存在人胚胎干細胞的倫理、道德問題，是細胞和組織工程理想的種子細胞，逐漸成為人們尋找治療糖尿病所需的胰島樣細胞的新來源。
　　 胰腺一十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)在人類又被稱為胰島素啟動因子-1(insulin promoter factor-1，IPF

3、-1)，是胰腺發(fā)育早期表達的一個轉錄因子，不僅對于腸內胚層背側及腹側胰腺萌芽的生長分化起著重要的作用[4]，還參與了胰島細胞分化發(fā)育成熟的過程。
　　 本研究擬構建含有PDX-1基因的真核表達載體，通過脂質體轉染技術，將所構建的重組表達載體轉入大鼠BMSCs中，篩選穩(wěn)定表達株細胞，為后續(xù)研究即誘導其向胰島樣細胞分化及移植治療糖尿病做好前期準備。
　　 方法：
　　 1.PDX-1基因cDNA片段的克隆及真核表達載

4、體的構建
　　 1.1根據(jù)GenBank上登錄的PDX-1的cDNA全長序列設計引物。以提取的總RNA為模板進行RT-PCR，將擴增出的PCR產物連接到pMD18-T載體上，然后進行測序并與GenBank上的PDX-1基因序列進行比對分析。
　　 1.2重組載體的構建與鑒定
　　 測序鑒定正確的重組質粒分別用引物對應的酶切位點進行雙酶切，回收相應的片段。同樣對真核表達載體pcDNA3.1(+)及綠色熒光蛋白載體p

5、EGFP-C1進行相應的酶切，回收載體片段。用T4DNA連接酶分別連接上述回收的片段，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109細胞，涂板，過夜培養(yǎng)，挑取克隆，提取質粒，雙酶切鑒定。
　　 2.大鼠BMSCs的體外培養(yǎng)及篩選含PDX-1的穩(wěn)定轉化株
　　 2.1利用全骨懿貼壁培養(yǎng)法分離、原代培養(yǎng)BMSCs
　　 2.2 BMSCs表面標記鑒定及生長曲線測定
　　 2.3細胞轉染
　　 2.4熒光顯微鏡觀

6、察pEGFP-PDX-1基因定位
　　 2.5利用遺傳霉素(Geneticin，G418)篩選轉染重組載體pcDNA3.1(+)-IPDX-1的穩(wěn)定轉化株細胞
　　 2.6 RT-PCR檢測PDX-1基因的表達
　　 結果：
　　 1.提取的總RNA完整性好，無降解。PDX-1基因的克隆，擴增出特異的DNA條帶，約883bp，與預期結果相符。經HindIII和BamHI雙酶切鑒定及測序分析，重組載體含有大

7、小、方向和讀碼框均正確的插入片段。
　　 2.分離獲得原代大鼠BMSCs，細胞免疫熒光示CD29、CD44陽性表達，CD34陰性表達，符合BMSCs特征。pEGFP-PDX-1基因定位：熒光顯微鏡觀察顯示轉染空質粒pEGFP-C1的細胞，綠色熒光分布于整個細胞，而轉染重組質粒pEGFP-PDX-1的細胞，細胞中央熒光更濃，提示細胞轉染定位于細胞核。
　　 3.穩(wěn)定轉染株的篩選與鑒定
　　 RT-PCR結果顯示未處

8、理正常組BMSCs和轉染pcDNA3.1(+)空載體的陰性對照組無PDX-1目的片段。pcDNA3.1(+)-PDX-1轉染株中擴增出PDX-1基因的目的片段，證明PDX-1基因成功轉入BMSCs并獲得pcDNA3.1(+)-PDX-1的穩(wěn)定轉化株。
　　 結論：
　　 1.本研究成功克隆小鼠PDX-1基因片段，并構建了重組真核表達載體
　　 2.通過融合綠色熒光蛋白的真核表達載體的轉染，證明轉入的PDX-1基因