抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)及在INTERNET上的3D模建分析.pdf

1、根據(jù)測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)鼠源性單抗重輕鏈可變特異性引物,從該室已構(gòu)建的抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)單克隆抗體VH、VL克隆載體上擴(kuò)增VH、VL基因,利用SOE法構(gòu)建其單鏈抗體VH-Linker-VL,經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切,連至表達(dá)載體pUC19/119上,經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl,通過菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆,采用熒光染色鏈終止法測(cè)定scFv序列,從Internet網(wǎng)上下載DNA分析工具與其來源基因進(jìn)行分析比較,發(fā)現(xiàn)基本吻合,同時(shí)Linker

2、序列為GGGGSGGGGSSGGGS,提示 單鏈抗體基因構(gòu)建成功.陽(yáng)性菌落用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳,在約26kD處可見條帶,采用間接免疫熒光抑制試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn),證實(shí)此單鏈抗體可特異性與TFR+細(xì)胞結(jié)合.利用Internet網(wǎng)上日內(nèi)瓦生物攻學(xué)研究所開發(fā)的ExPASy分子生物學(xué)服務(wù)器,對(duì)scFv基因的氨基酸序列進(jìn)行分析,包括理化特性分析、氨基酸組成和分子量分析、序列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等.同時(shí),利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源性模建(

3、Swiss-Model)系統(tǒng)做了VH-Linker-VL、VL-Linker-VH、VH-VL、VL-VH的蛋白質(zhì)分子3D模建.利用英國(guó)Bath大學(xué)開發(fā)的WAM服務(wù)系統(tǒng),對(duì)其來源抗體進(jìn)行模建.使用Spdbv軟件對(duì)上述各模型結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)抗TFR單抗VH、VL在此單鏈抗體中的順序?qū)?duì)單鏈抗體的結(jié)構(gòu)有結(jié)構(gòu)有所影響.該研究采用的分子生物學(xué)技術(shù)及利用Internet上的服務(wù)系統(tǒng)、在線數(shù)據(jù)庫(kù)和共享軟件等網(wǎng)絡(luò)工具,為單鏈抗體的構(gòu)建及其理論分析提