miR-568抑制乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移機制的研究.pdf

1、背景：
　　乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可分為多個層次多個步驟，轉(zhuǎn)移是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，常常導(dǎo)致病人的高死亡率。由于轉(zhuǎn)移過程比較復(fù)雜，我們需要從基礎(chǔ)和臨床兩方面入手，深入揭示乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機制，以利于獲取腫瘤發(fā)生的早期預(yù)警信號，及時的進行診斷和干預(yù)，最終提高患者的治療效果和生活質(zhì)量，緩解、減輕社會和個人的負(fù)擔(dān)。腫瘤轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜，通常涉及到許多轉(zhuǎn)移相關(guān)分子，而對單個分子的干預(yù)可能達不到所希望的成效。因為miRNA可以同時靶向多個腫瘤轉(zhuǎn)移

2、相關(guān)分子，使上述難題得以部分解決。近年來，miRNA與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究漸成為醫(yī)學(xué)熱點，其中關(guān)于miRNA與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究尤為火熱，但目前進展還不盡如人意，許多問題尚待解決。除了已報道的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制miRNA，是否有新的miRNA參與其中呢？若存在，這些新的miRNA分子下調(diào)了何種轉(zhuǎn)移相關(guān)分子（靶分子）？靶分子（早已報道的或最近發(fā)現(xiàn)的）參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體機制是什么？新miRNA分子逆轉(zhuǎn)腫瘤表型的能力是否可以在基礎(chǔ)與臨床研

3、究中得到一致性的證據(jù)呢？種種問題的提出和最終解決，必將為乳腺癌患者的治療帶來新的希望。
　　目的：
　　尋找并鑒定參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新miRNA分子，初步探討新miRNA分子以何種途徑來影響乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這種作用結(jié)果是否可以在基礎(chǔ)功能研究和臨床觀察、檢測中獲得統(tǒng)一的認(rèn)識，最終為乳腺癌的早期預(yù)警、分子診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．依據(jù)GEO profiles軟件查詢并分析NFAT5在乳腺

4、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)中的表達情況。qRT-PCR和WB方法檢測NFAT5在乳腺癌細(xì)胞系中的表達，篩選得到高表達和低表達 NFAT5的細(xì)胞系。siNFAT5 mimics轉(zhuǎn)染或者pLKO.1-GFP-shNFAT5穩(wěn)定感染MDA-MB-231細(xì)胞系后，劃痕實驗、遷移侵襲實驗、尾靜脈注射裸小鼠內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實驗觀察細(xì)胞的遷移和侵襲能力。裸鼠成瘤實驗觀察乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)生長和增值狀況。
　　2．芯片結(jié)果結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測得知，NFAT5可

5、能受到miR-568的調(diào)控。利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證預(yù)測結(jié)果。qRT-PCR方法檢測miR-568在乳腺癌細(xì)胞系及臨床組織標(biāo)本中的表達。將miR-568 mimics、antagomiR-568 mimics分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞后，檢測NFAT5的表達并且觀察目的細(xì)胞侵襲能力的變化。將穩(wěn)定感染pGCsil-miR-568的MDA-MB-231細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)后肢背部的皮下或尾靜脈注射裸小鼠，觀察其原位成瘤

6、及肺轉(zhuǎn)移情況。
　　3．qRT-PCR及WB方法檢測S100A4在乳腺癌細(xì)胞系中的表達，ChIP實驗驗證NFAT5與S100A4啟動子的結(jié)合情況。將不同濃度的 siNFAT5 mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，檢測 S100A4 mRNA及其蛋白質(zhì)的表達變化。在MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-568 mimics或antagomiR-568 mimics后，qRT-PCR檢測S100A4 mRNA的

7、表達變化。在MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siNFAT5或者siS100A4后，qRT-PCR、WB及間接免疫熒光實驗檢測EMT相關(guān)分子的表達（主要為E-cadherin和Vimentin）。免疫組織化學(xué)實驗檢測不同級別乳腺癌組織中NFAT5、S100A4、E-cadherin及Vimentin的表達，并分析其相關(guān)性。siNFAT5、siS100A4或miR-568 mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，qRT-PCR檢測CD44

8、、RhoA、MMP2和MMP9的表達，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，WB檢測ERK、Akt及其磷酸化的表達水平。
　　4．qRT-PCR及ELISA實驗檢測乳腺癌細(xì)胞系及臨床送檢血液中VEGF-C的表達水平，分析其與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。ChIP實驗驗證NFAT5與VEGF-C啟動子的結(jié)合情況。將miR-568或siNFAT5 mimics轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，qRT-PCR及ELISA實驗檢測VEGF-C的表達
　　

9、5．qRT-PCR檢測乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌患者組織中Hotair的表達。下調(diào)或過表達Hotair后，觀察乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的變化。單獨或聯(lián)合下調(diào)Hotair、SUZ12或者EZH2后，qRT-PCR檢測miR-568的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1．依據(jù)GEO profiles軟件查詢并分析已發(fā)表的乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的芯片數(shù)據(jù)可知，NFAT5在轉(zhuǎn)移能力較強的乳腺癌細(xì)胞中的表達較高。經(jīng)篩選得到了高表達和低表達NFAT5的乳腺癌

10、細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7。干涉NFAT5的表達后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。NFAT5表達的下調(diào)抑制乳腺癌細(xì)胞的原位成瘤及肺臟轉(zhuǎn)移，體內(nèi)外實驗結(jié)果一致表明，NFAT5能夠促進乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　2．與芯片結(jié)果和生物信息學(xué)預(yù)測相吻合，雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示miR-568可以靶向抑制NFAT5的表達，實時定量PCR結(jié)果顯示在乳腺癌細(xì)胞系及臨床乳腺癌組織樣本中miR-568與NFAT5的表達呈負(fù)

11、相關(guān)。miR-568表達上調(diào)或下調(diào)試驗結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力隨之下降或上升，同時檢測NFAT5的表達變化。體內(nèi)實驗觀察到miR-568可以部分抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，但顯著降低其肺臟轉(zhuǎn)移能力。綜上所述，miR-568通過下調(diào)NFAT5的表達抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　3．S100A4與NFAT5在乳腺癌細(xì)胞系中的表達趨勢基本相符。ChIP實驗結(jié)果表明，NFAT5可以結(jié)合到S100A4的啟動子區(qū)上，并正向調(diào)控其基因表達，

12、MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNFAT5或siS100A4后，qRT-PCR、WB及間接免疫熒光試驗結(jié)果表明，NFAT5通過上調(diào)S100A4來調(diào)控EMT相關(guān)分子E-cadherin，Vimentin等的表達。臨床乳腺癌組織標(biāo)本的免疫組化結(jié)果提示，NFAT5、S100A4的表達與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)，與Vimentin呈正相關(guān)，并且其與臨床腫瘤TNM分級有良好的一致性。miR-568、siNFAT5或siS100A4轉(zhuǎn)染MDA-

13、MB-231細(xì)胞后，腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子CD44、RhoA、MMP2、MMP9等的表達均被下調(diào)，ERK及Akt的磷酸化程度降低，腫瘤細(xì)胞的抗脫落凋亡效應(yīng)下降。miR-568通過下調(diào)NFAT5間接抑制S100A4的表達，最終抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　4．qRT-PCR及ELISA試驗結(jié)果表明，在高侵襲力的乳腺癌細(xì)胞系中VEGF-C的表達相對較高。與技術(shù)縮胸或良性乳腺疾病患者相比，淋巴結(jié)或肺轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的送檢血液樣本中VEGF-C的濃

14、度變化有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。與S100A4的情形相同，VEGF-C受到NFAT5的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控，qRT-PCR及 ELISA實驗證實MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-568或siNFAT5 mimics后，VEGF-C的表達與分泌受到抑制。miR-568通過下調(diào)NFAT5間接抑制VEGF-C的表達，從而起到抑癌基因的作用。
　　5．qRT-PCR檢測Hotair在乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌及其匹配癌旁組織中的表達情況，Hotair的表達

15、與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。以不同組合方式干涉Hotair、SUZ12或EZH2均可上調(diào)miR-568的表達，已知LincRNA Hotair可以表觀沉默基因的表達，據(jù)推測Hotair有可能通過表觀遺傳沉默的方式下調(diào)miR-568的表達來促進乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　1.體內(nèi)外實驗證實了NFAT5可以促進乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，其可以作為一個潛在的有效的治療靶點。
　　2. miR-568在乳腺癌細(xì)胞中的表達較低，

16、其可以通過下調(diào)NFAT5的表達抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　3. NFAT5通過上調(diào)S100A4的表達來間接誘導(dǎo)EMT和促存活信號的發(fā)生，過表達miR-568或干涉掉NFAT5可逆轉(zhuǎn)上述表型。臨床樣本的免疫組化數(shù)據(jù)與上述基礎(chǔ)功能的研究結(jié)果體現(xiàn)出良好的一致性。miR-568通過下調(diào)NFAT5間接抑制S100A4的表達，最終表現(xiàn)為乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移抑制。
　　4. NFAT5通過誘導(dǎo)VEGF-C的表達與分泌進而刺激淋巴管血管生成。過