干細胞誘導分化為神經(jīng)細胞的研究.pdf

1、目的：研究干細胞向神經(jīng)細胞分化不僅可以應用于臨床，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森癥、腦卒中、脊髓病變患者進行細胞移植，使其盡快康復；還可以作為研究哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的體外模型，了解神經(jīng)分化過程中基因表達調(diào)控的變化，并方便進行基因操作。 既往認為神經(jīng)細胞是終末分化細胞，其損傷后很難再由神經(jīng)干細胞補充。因此，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷不能再生，尤其哺乳類動物神經(jīng)元缺乏再生能力。 從上世紀80年代開始，有研究表明移植外周神經(jīng)和胎髓能促

2、進脊髓損傷軸突的再生。以后，諸多實驗顯示了脊髓損傷后可能會再生。最近，有研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷可由神經(jīng)干細胞來補充。而且，其它來源的干細胞，如：骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)和胚胎干細胞(embryonicstemcells，ESCs)在一定條件下均可分化為神經(jīng)元樣細胞。但是，誘導分化的比例還很低。 將大鼠MSCs移植到脊髓挫裂傷的大鼠體內(nèi)，顯示了明顯的功能恢復。研究者直接地或?qū)⒋?/p>

3、鼠MSCs與神經(jīng)球細胞共培養(yǎng)后，通過局部注射的方式移植進大鼠損傷脊髓內(nèi)，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠的后肢運動功能比對照組明顯恢復，形態(tài)學檢測顯示移植的MSCs位于損傷區(qū)中心，且朝向損傷中心牽拉宿主組織，阻止脊髓空洞的形成。雖然諸多研究表明MSCs可部分修復損傷脊髓的解剖連接，但目前仍無充分證據(jù)證明MSCs能夠恢復損傷脊髓的神經(jīng)傳導功能。 本實驗擬摸索出一種簡便有效、無毒性的體外大比例誘導干細胞分化為神經(jīng)細胞的方法，并通過移植干細胞研究其體內(nèi)

4、向神經(jīng)細胞分化。并進一步通過基因芯片分析證實誘導結(jié)果，篩選向神經(jīng)細胞分化的主導基因，研究干細胞向神經(jīng)細胞誘導分化的機理。 方法： 1.MSCs的分離培養(yǎng)、鑒定和向神經(jīng)細胞誘導分化 1.1在無菌條件下取Wistar大鼠股骨和脛骨骨髓細胞做原代培養(yǎng)。 1.2根據(jù)細胞貼壁性能不同，篩選易貼壁但貼壁不牢的細胞進行傳代培養(yǎng)。 1.3免疫細胞化學染色法鑒定MSCsCD45和CD90的表達情況。 1.4

5、向神經(jīng)細胞誘導分化：β-巰基乙醇+DMSO+降低血清濃度 1.5免疫細胞化學染色法檢測NSE。 2.ESCs培養(yǎng)、鑒定和向神經(jīng)細胞誘導分化 2.1鈣鈷法堿性磷酸酶染色鑒定未分化ESCs。 2.2免疫熒光法檢測神經(jīng)細胞特異性抗原Nestin、NSE、NCAM1、NF-L和GFAP。 2.3ESCs(鼠ES細胞系AB2.1由南加州大學醫(yī)學院惠贈)按常規(guī)培養(yǎng)于飼養(yǎng)層細胞上。誘導分化時去飼養(yǎng)層細胞，重新接

6、種于無包被的培養(yǎng)皿中，使用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液，逐漸更換為無血清神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液。 3.MSCs體內(nèi)誘導分化為神經(jīng)細胞 3.1BrdU(5’-溴脫氧尿苷)體外標記MSCs。 3.2MSCs移植。 3.2.1制備大鼠脊髓左側(cè)半橫斷損傷模型。 3.2.2實驗組12只：術后立即向損傷區(qū)遠端注射MSCs，對照組12只：注射等量磷酸緩沖鹽溶液。 3.3移植后鑒定。 3.3.1采用BBB評分系統(tǒng)評

7、估大鼠行為學改變。 3.3.2心臟灌流固定大鼠脊髓組織。 3.3.3免疫組織化學染色法觀察BrdU標記的MSCs在脊髓損傷處存活情況。 3.3.4取材前48小時行辣根過氧化物酶(HRP)逆行示蹤。 3.3.5HRP示蹤結(jié)果觀察脊髓損傷處神經(jīng)通路的重構(gòu)建。 3.3.6皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)測定脊髓損傷處神經(jīng)通路傳導功能的恢復。 4.表達基因芯片分析采用AffymetrixMOE430A

8、小鼠表達譜芯片進行未分化及分化后第4、10天細胞基因表達譜差異的分析。 5.半定量RT-PCR在mRNA水平檢測ESCs、神經(jīng)干細胞及神經(jīng)細胞相關基因。 6.誘導分化前后細胞端粒酶活性檢測(TRAP)。 7.統(tǒng)計學分析。 結(jié)果： 一、MSCs分離培養(yǎng)和向神經(jīng)細胞誘導分化1.MSCs免疫細胞化學法檢測CD45完全陰性，CD9070％陽性。2.MSCs在預誘導和更換為無血清培養(yǎng)液后產(chǎn)生似神經(jīng)細胞，細胞

9、80％表達NSE。 二、MSCs體內(nèi)向神經(jīng)細胞誘導分化 1.術后實驗組大鼠后肢運動功能比對照組恢復明顯，1周、2周、3周、4周，8周BBB評分均高于對照組。 2.術后1周行石蠟切片，免疫組織化學染色顯示在實驗組大鼠脊髓損傷區(qū)遠端檢測到BrdU陽性細胞。 3.術后2個月行冰凍切片，在實驗組大鼠的損傷脊髓近側(cè)端的腹側(cè)角檢測到HRP陽性細胞，而于對照組大鼠未檢測到HRP陽性細胞。 4.術后2個月行CSE

10、P測定，實驗組大鼠的CSEP波形恢復但波幅減低，潛時期延長，對照組大鼠未見CSEP引出。 三、ESCs體外誘導分化為神經(jīng)細胞未分化的ESCs聚集成團狀生長，細胞排列緊密，集落邊界清楚，堿性磷酸酶染色呈強陽性，胞漿布滿棕黑色顆粒。使用序貫誘導法可將ESCs大比例誘導分化為神經(jīng)樣細胞，光鏡下觀察細胞形態(tài)均一、胞體圓亮、突起細長。分化細胞表達多種神經(jīng)細胞標志物，免疫熒光法示NSE、NCAM1陽性率＞80％，GFAP＜1％。 四

11、、ESCs體外誘導分化為神經(jīng)細胞機理研究 基因芯片檢測誘導后第10天細胞Nestin、Sox2、Cdk5、Dnmt3A、NSE、NF-M、NCAM1、MAP2等神經(jīng)特異性基因均有高表達，且有GABA受體、谷氨酸脫羧酶(GAD)表達，其他神經(jīng)遞質(zhì)受體及其合成酶等未見表達，說明誘導后細胞大多為GABA能神經(jīng)元。膠質(zhì)細胞標志基因GFAP、MBP未檢測到，其他胚層的標志性基因也沒有表達。半定量RT-PCB亦證實上述結(jié)果。 未分化

12、ESCs端粒酶活性最強，隨分化天數(shù)增加，端粒酶活性逐漸下降，至第10天，端粒酶活性已經(jīng)很弱，但仍強于PMEF-P3。 結(jié)論： 1.應用beta-巰基乙醇和無血清培養(yǎng)液誘導MSCs分化為神經(jīng)細胞可達到80％的分化率。 2.局部注射MSCs移植進脊髓損傷區(qū)，MSCs可在損傷區(qū)存活并分化為神經(jīng)元，在損傷局部形成神經(jīng)元通路，使損傷脊髓的遠端和近端建立聯(lián)系，從而使脊髓神經(jīng)纖維傳導功能恢復。 3.通過我們實驗摸索出的