東北虎胎盤(pán)microRNA表達(dá)譜、轉(zhuǎn)錄組及microRNA-424調(diào)節(jié)MAPK通路分子機(jī)制研究.pdf

1、胎盤(pán)是哺乳動(dòng)物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長(zhǎng)成的母子間交換物質(zhì)的過(guò)渡性器官，具有物質(zhì)交換、防御、合成和免疫等功能。隨著東北虎基因組數(shù)據(jù)的公布，東北虎表觀遺傳學(xué)成為一個(gè)可開(kāi)拓的前沿領(lǐng)域。MicroRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸(nt)的非編碼單鏈RNA分子，其主要參與基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。本研究應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)東北虎胎盤(pán)組織進(jìn)行microRNA表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄組分析，并對(duì)胎盤(pán)組織特異microRNA進(jìn)行功

2、能驗(yàn)證，得到以下結(jié)論:
　　1、利用RNA-seq技術(shù)對(duì)東北虎胎盤(pán)組織進(jìn)行small RNA測(cè)序，去除接頭和低質(zhì)量序列后，將 clean reads與東北虎基因組（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/term=tiger）進(jìn)行比對(duì)、注釋及表達(dá)分析。獲得東北虎胎盤(pán)組織microRNA表達(dá)譜，其中包括465個(gè)microRNA，經(jīng)聚類(lèi)分析分為41個(gè)簇(cluster)和35個(gè)家族(family)，其中胎

3、盤(pán)組織特異性的microRNA有microRNA-424，microRNA-450，microRNA-495，microRNA-376a，microRNA-184，microRNA-369和microRNA-503，利用TAM tools(http://www.cuilab.cn/tam)進(jìn)行功能分析，其功能主要包括胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、血管生成、骨再生、肌肉發(fā)育、凋亡與抗凋亡、細(xì)胞增殖與分化、粒細(xì)胞生成、免疫反應(yīng)應(yīng)答和激素分泌調(diào)節(jié)等。

4、　　2、對(duì)東北虎胎盤(pán)組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行生物學(xué)分析，包括其表達(dá)基因的GeneOntology(GO)和Clusters of Orthologous Groups of proteins(COG)分析。其中21103條東北虎基因在GO分析中被注釋到45個(gè)GO terms，有8462條基因在COG中被注釋、分類(lèi)。利用靶基因預(yù)測(cè)工具TargetScan和miRanda對(duì)靶基因在東北虎胎盤(pán)組織轉(zhuǎn)錄組上進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得東北虎胎盤(pán)組織microRNA調(diào)控

5、靶基因，描述了microRNA靶基因在胎盤(pán)組織中生物學(xué)功能，同時(shí)繪制了microRNA調(diào)控靶基因?qū)崿F(xiàn)胎盤(pán)組織功能的分子網(wǎng)絡(luò)圖。
　　3、選取胎盤(pán)組織中特異的microRNA，利用Real time PCR、組織原位雜交和Westen blotting分析microRNA-424及其靶基因MAP2K1在東北虎和家貓?zhí)ケP(pán)組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示東北虎胎盤(pán)組織中microRNA-424的表達(dá)顯著低于家貓?zhí)ケP(pán)組織（**p＜0.01），而其靶

6、基因MAP2K1的表達(dá)在東北虎胎盤(pán)組織中顯著高于家貓?zhí)ケP(pán)組織（**p＜0.01）。
　　4、通過(guò)靶位點(diǎn)突變及雙熒光素酶分析得出MAP2K13'UTR區(qū)域microRNA-424靶位點(diǎn)突變后，熒光素酶活性無(wú)顯著差異，而未突變組熒光素酶活性顯著下調(diào)（**p＜0.01），證實(shí)microRNA-424可直接靶向結(jié)合MAP2K13'UTR區(qū)域，并在東北虎成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)microRNA-424后，Westen blotting證實(shí)micr

7、oRNA-424可顯著下調(diào)MAP2K1的蛋白表達(dá)量（**p＜0.01）。為驗(yàn)證microRNA-424在東北虎成纖維細(xì)胞中的生物學(xué)功能，Westen blotting評(píng)估侵染microRNA-424病毒顆粒后的東北虎成纖維細(xì)胞MAP2K1基因下游ERK1/2的磷酸化及蛋白表達(dá)量，MTT法評(píng)定東北虎成纖維細(xì)胞增值能力，結(jié)果證實(shí)，microRNA-424不但直接調(diào)節(jié)MAP2K1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)影響下游ERK1/2的表達(dá)，從而起到抑制細(xì)胞增殖