擬南芥MicroRNA通路新因子的鑒定和作用機(jī)制研究.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)大約21個(gè)核苷酸長(zhǎng)的小RNA(small RNA，sRNA)，在很多生物學(xué)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA的產(chǎn)生過(guò)程包括由PolⅡ轉(zhuǎn)錄出其前體(primary miRNA，pri-miRNA)和由Dicer-like1(DCL1)對(duì)pri-miRNA進(jìn)行加工形成成熟的miRNA兩個(gè)過(guò)程。miRNA與ARGONAUTE1(AGO1)結(jié)合形成RNA沉默復(fù)合物(RNA-Induced Silencing

2、 Complex，RISC)，主要通過(guò)切割靶基因mRNA或抑制翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
　　為了加深我們對(duì)miRNA通路機(jī)制的理解，我們利用一個(gè)高效表達(dá)可使擬南芥表皮毛成簇的人工miRNA的轉(zhuǎn)基因系，建立了針對(duì)miRNA通路的遺傳篩選體系。通過(guò)誘變篩選，我們得到了一些miRNA活性增強(qiáng)（enhanced miRNA activity，ema）或減弱（compromised miRNA activity，cma）的突變體。在本研究中，我們

3、鑒定和研究了cma33突變體。CMA33編碼一個(gè)核蛋白XCT(XAP5 CIRCADIANTIMEKEEPER)，XCT之前被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)植物的節(jié)律和乙烯反應(yīng)。cma33/xct突變體中，miRNA以及另外兩類(lèi)sRNAs，依賴(lài)于DCL3的heterochromatic siRNA(hc-siRNA)和依賴(lài)于DCL4的trans-acting siRNA(ta-siRNA)的積累都下降。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)cma33/xct突變引起了DCL1、DC

4、L3和DCL4表達(dá)量的下降。與此相一致，cma33/xct突變體中PolⅡ在這三個(gè)DCL基因上的結(jié)合減少，這意味著XCT通過(guò)調(diào)控DCL1、DCL3和DCL4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)sRNA的生成。
　　我們之前報(bào)道的EMA1編碼一個(gè)importinβ家族蛋白，可以負(fù)調(diào)節(jié)miRNA進(jìn)入AGO1的過(guò)程。在本研究中，我們進(jìn)一步以ema1突變體為材料，進(jìn)行了ema1的抑制子篩選(suppressor of ema1，soe)，以更敏感地獲得調(diào)節(jié)miRN

5、A產(chǎn)生和活性的新因子。我們分析了其中兩個(gè)突變體:soe1和soe2。SOE1和SOE2分別編碼了ELP2和ELP5，它們是高度保守的Elongator復(fù)合物的兩個(gè)亞基。我們發(fā)現(xiàn)，在soe1和soe2突變體中，PolⅡ在編碼miRNA基因上的結(jié)合量下降，部分pri-miRNA的積累下降，說(shuō)明Elongator可以促進(jìn)MIR的轉(zhuǎn)錄。此外，Elongator與負(fù)責(zé)pri-miRNA加工的Dicing復(fù)合物相互作用，而且Elongator的缺失