前列腺癌細(xì)胞結(jié)合單鏈抗體的篩選、表達(dá)純化及其功能初步研究.pdf

1、本研究旨在篩選出與人前列腺癌細(xì)胞結(jié)合特異性較高的抗體，以期有助于前列腺癌的早期診斷與低損傷性治療。 首先用人前列腺癌細(xì)胞PC3、C4-2、DU145的膜蛋白混合物免疫BALB/c小鼠，從免疫鼠脾細(xì)胞中提取總RNA，通過RT-PCR構(gòu)建出組合單鏈抗體cDNA文庫，通過噬菌體表面呈現(xiàn)，用人前列腺癌細(xì)胞PC3對(duì)噬菌體-單鏈抗體庫(phage-scFv)進(jìn)行親和富集及phage-ELISA篩選鑒定，獲得一種與人前列腺癌細(xì)胞系PC3結(jié)合特

2、異性較高的單鏈抗體scFvP-9，其與PC3最小結(jié)合滴度與對(duì)照細(xì)胞LNCaP最小結(jié)合滴度相比低150多倍，說明其與PC3細(xì)胞具有較強(qiáng)的結(jié)合特性。經(jīng)序列測定及與鼠抗體可變區(qū)序列庫進(jìn)行同源性比較，確定其VH屬于鼠抗體重鏈可變區(qū)基因家族Ⅲ(C)亞組；其VL屬于鼠抗體κ輕鏈可變區(qū)基因家族ⅣV組。且未發(fā)現(xiàn)任何已知單鏈抗體與之序列相同。 將scFvP-9插入pTIG-Trx載體，單鏈抗體在大腸桿菌BL21(DE3)中得到可溶性表達(dá)，ELIS

3、A檢測表明誘導(dǎo)后在BL21(DE3)胞漿中的單鏈抗體可與PC3細(xì)胞有效結(jié)合。 利用MTT比色實(shí)驗(yàn)初步研究了scFvP-9對(duì)多種腫瘤細(xì)胞及正常肝細(xì)胞HL02的生物作用：scFvP-9不影響HL02細(xì)胞及惡性程度低的人前列腺癌細(xì)胞LNCaP的生長，但對(duì)人前列腺癌細(xì)胞PC3、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肺癌細(xì)胞PLA801D細(xì)胞均有生長抑制作用；且孵育時(shí)間為24h時(shí)抑制細(xì)胞生長增殖的作用最突出。 在人宮頸癌裸鼠荷瘤模型體內(nèi)驗(yàn)證了s

4、cFvP-9的抑瘤作用。PBS組宮頸癌移植瘤呈持續(xù)生長，scFvP-9處理組移植瘤生長受到明顯抑制，尤其是瘤周皮下給藥組更為顯著，而非相關(guān)抗體處理組情況類似于PBS組。病理切片結(jié)果顯示，scFvP-9處理組的腫瘤組織與PBS組相比，包膜完整、界限清晰，并有大片組織壞死；而非相關(guān)抗體組未見此現(xiàn)象。說明scFvP-9具有較好的抑瘤作用。 本研究獲得的與人前列腺癌細(xì)胞系PC3結(jié)合特異性較高的單鏈抗體為前列腺癌的早期診斷與靶向治療打下基