MiR-133a抗阿霉素誘導的H9C2細胞凋亡.pdf

1、目的：構建miR—133a的真核表達載體，研究miR—133a在阿霉素誘導的H9C2細胞凋亡中的作用，為心血管疾病的靶向治療研究提供理論依據。
　　 方法：(1)設計并合成DNA模板引物，用T4 DNA連接酶將pre—mir—133a連接到線性化的Pgenesil—1．1質粒中，對重組質粒進行酶切及測序鑒定。(2)以Lipofectamine TM2000 Reagent將鑒定正確的重組質粒、空質粒、mo—mir—133a in

2、hibitor以及MicroRNA inhibitor N．C瞬時轉染H9C2細胞，用流式細胞儀及倒置熒光顯微鏡檢測轉染效率。(3)轉染后72h加入阿霉素損傷細胞，加藥后分為4組：空質粒對照組，重組質粒組，Inhibitor組，Inhibitor N．C組。(4)qRT—PCR檢測各組細胞Caspase—9及PDCD4在mRNA水平的變化。(5)Western blot檢測各組細胞Caspase—9及PDCD4蛋白水平的表達。
　

3、　 結果：(1)成功構建了miR—133a真核表達載體。(2)用重組質粒Pgenesil—1．1—pre—mir—133a瞬時轉染H9C2細胞，轉染效率可達70％以上。(3)qRT—PCR結果示轉染重組質粒及Inhibitor后，與轉染空質粒的對照組相比，細胞中Caspase．9及PDCD4基因的mRNA表達水平均沒有明顯變化(P>0．05)。(4)Western blot結果示轉染空質粒組細胞中，Caspase—9及PDCD4蛋白有

4、低表達；轉染重組質粒后，上調miR—133a的表達，Caspase—9及PDCD4蛋白的表達水平降低(0．409±0．009 vs0．245±0．007，P<0．05;0．395±0．008 vs0．236±0．019，P<0．05)；轉染Inhibitor抑制了miR—133a的表達，Caspase—9及PDCD4蛋白表達水平顯著升高(0．409±0．009 vs0．675±0．018，P<0．05;0．395±0．008 vs0．6