諾卡菌多重PCR及Real-time PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、諾卡菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，它引起的諾卡菌病可發(fā)生于許多人種、職業(yè)、年齡，主要引起肺部、皮膚感染以及急性或慢性化膿性或肉芽腫性病變，有時(shí)會(huì)侵襲腦部，形成膿腫，嚴(yán)重時(shí)甚至能夠引起病人的死亡。研究人員通過(guò)大量的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，諾卡菌感染病例正在逐年增加。諾卡菌的常規(guī)鑒定方法是分離培養(yǎng)，需要花費(fèi)大量的時(shí)間和人力，通常需要一至三周完成。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，諾卡菌的PCR檢測(cè)方法也得到了發(fā)展。多重PCR和Taqman探針RealtimePCR方法具有

2、特異性好、靈敏度高，自動(dòng)化程度高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)檢測(cè)。將這兩種方法應(yīng)用到諾卡菌的檢測(cè)中，為快速分離和臨床診斷諾卡氏菌提供一定的參考依據(jù)。
　　目的：
　　本研究擬建立諾卡菌多重PCR及TaqManReal-timePCR的檢測(cè)方法，為臨床快速、準(zhǔn)確鑒別診斷諾卡菌提供可靠的參考標(biāo)準(zhǔn)。
　　方法：
　　1、以諾卡菌的16SrRNA、rpoB、SecA1為靶基因，設(shè)計(jì)這三個(gè)基因的特異引物，用諾卡菌標(biāo)

3、準(zhǔn)株DSM43003、臨床株CDC51的DNA為模板做單重PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證引物的特異性。在單重PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上優(yōu)化多重PCR方法的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，同時(shí)對(duì)44株諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)株、44株臨床分離株和7株非諾卡氏菌株進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)該方法的靈敏度、特異度和實(shí)用性。
　　2、基于諾卡菌rpoB基因設(shè)計(jì)TaqMan熒光定量PCR特異的引物與探針，提取鼻疽諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM43003的DNA，擴(kuò)增rpoB基因并純化PCR產(chǎn)物，連接pMD-18

4、T載體，導(dǎo)入JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子并提取質(zhì)粒，10×倍比稀釋所得質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線確定所建立方法的檢測(cè)下限;用29其他致病菌驗(yàn)證引物和探針的特異性;使用痰液模擬標(biāo)本驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用性。
　　結(jié)果：
　　1、利用單對(duì)引物對(duì)其中2株諾卡菌(DSM43003、CDC51)進(jìn)行擴(kuò)增，出現(xiàn)的條帶均為與目的片段長(zhǎng)度一致的單一條帶，經(jīng)測(cè)序并經(jīng)BLAST驗(yàn)證擴(kuò)增的片段為目的基因。建立的多重PCR方法，44株諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)株中有

5、43株(97.7％)、44株臨床分離株中有42株(95.5％)3條片段都顯示，7珠對(duì)照菌株均未顯示條帶。
　　2、建立諾卡菌TaqMan熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定該方法可以檢測(cè)到23copy/反應(yīng)管目的基因，痰液模擬標(biāo)本檢測(cè)2.0×102cfu/ml的細(xì)菌含量即可被檢出;特異性實(shí)驗(yàn)中，只有諾卡菌有明顯的S型擴(kuò)增，且熒光信號(hào)強(qiáng)，其他菌株未見(jiàn)特異性擴(kuò)增。
　　結(jié)論：
　　1.研究建立的多重PCR、Taqman探針R