SDF-1α-CXCR4軸對(duì)心肌干細(xì)胞遷移及歸巢修復(fù)心肌的影響.pdf

1、背景與目的:
　　心肌梗死(myocardiuminfarction,MI)是由于冠狀動(dòng)脈狹窄、閉塞導(dǎo)致心肌壞死后引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病,其最終結(jié)果往往會(huì)導(dǎo)致心力衰竭,目前藥物治療、內(nèi)科介入治療、外科冠狀動(dòng)脈旁路搭橋術(shù)僅僅只能恢復(fù)局部心肌組織的血液供應(yīng),并不能從根本上修復(fù)已經(jīng)發(fā)生壞死的心肌組織。以往的觀念認(rèn)為心臟是一個(gè)終末分化器官,當(dāng)發(fā)生損傷時(shí),心肌不能再生,僅能通過心肌肥大來進(jìn)行代償。但是,近年來的研究表明,在成年個(gè)體

2、心臟內(nèi)存在有一群原始的心肌干細(xì)胞(cardiacstemcells,CSCs),可以分化為心肌、平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞,參與損傷修復(fù),CSCs移植可以減少梗死面積,CSCs的發(fā)現(xiàn)為心肌損傷修復(fù)提供了新策略。研究表明,CSCs主要存在于心尖、心房等干細(xì)胞巢內(nèi),在心肌發(fā)生損傷時(shí),CSCs如何動(dòng)員及向損傷區(qū)域歸巢的機(jī)制尚不清楚。
　　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor,SDF-1α)屬于CXC族趨化因子

3、成員,是生物體內(nèi)一種關(guān)鍵的細(xì)胞趨化因子。CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)是SDF-1α的受體,表達(dá)于多種干/祖細(xì)胞表面,可與SDF-1α耦合介導(dǎo)其遷移。我們及其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血、血管內(nèi)膜損傷可上調(diào)SDF-1α的表達(dá),介導(dǎo)多種干細(xì)胞歸巢新生血管、修復(fù)損傷內(nèi)皮。最近研究發(fā)現(xiàn)SDF-1α參與心梗后CSCs分化調(diào)控,可促進(jìn)血管新生、減小心梗面積。但SDF-1α/CXCR4軸調(diào)控CSCs歸巢的作用及機(jī)制

4、有待進(jìn)一步研究。
　　磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)蛋白家族是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,廣泛表達(dá)于多種組織與細(xì)胞中,參與細(xì)胞遷移、增殖、分化、凋亡、血管生成和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明,PI3K參與SDF-1α/CXCR4調(diào)控的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等多種干/祖細(xì)胞趨化作用及遷移。VEGF基因轉(zhuǎn)染可促進(jìn)CSCs向心肌梗死區(qū)域歸巢,但PI3K/

5、Akt的抑制劑wortmannin可阻斷這一效應(yīng),這一結(jié)果表明,PI3K在CSCs的遷移、歸巢中發(fā)揮作用。我們前期的實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道表明,CSCs表面表達(dá)有CXCR4,CXCR4可通過激活PI3K途徑促進(jìn)其他干/祖細(xì)胞遷移、歸巢,SDF-1α是否可以通過CXCR4/PI3K途徑介導(dǎo)CSCs的遷移、歸巢?
　　本課題觀察SDF-1α/CXCR4軸對(duì)CSCs體外遷移的影響,同時(shí)探討PI3K通路是否參與SDF-1α/CXCR4軸介導(dǎo)的CS

6、Cs遷移;采用心梗區(qū)注射SDF-1α基因聯(lián)合梗死周邊注射CSCs的方法,評(píng)價(jià)SDF-1α/CXCR4軸在CSCs歸巢及心肌再生中的作用,并探討PI3K通路在其中的作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建rAAV1-SDF1α-eGFP載體。根據(jù)基因序列合成SDF-1αcDNA,插入pSNAV2.0-mCMV-EGFP的SalⅠ和BglⅡ位點(diǎn),即合成pSNAV2.0-SDF1α-EGFP質(zhì)粒。合成的質(zhì)粒通過酶切、PCR和測(cè)序鑒定。采用

7、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,pSNAV2.0-SDF1α-EGFP與輔助質(zhì)粒pAAV-R2C1、pHelper三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,產(chǎn)生rAAV1-SDF1α-eGFP。將構(gòu)建的rAAV1-SDF1α-EGFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,免疫熒光檢測(cè)GFP及心肌細(xì)胞內(nèi)SDF-1α表達(dá)情況,檢測(cè)重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　2.心臟酶消化培養(yǎng)聯(lián)合免疫磁珠分選(MACS)純化c-kit心肌干細(xì)胞,并作克隆培養(yǎng),免疫熒光檢測(cè)分選細(xì)胞表面c-kit表達(dá)情

8、況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)MACS分選前后的細(xì)胞表面標(biāo)志物c-kit和CD45或Sca-1或CXCR4的表達(dá)情況。c-kit心肌干細(xì)胞在分化誘導(dǎo)液中培養(yǎng)21天后,免疫熒光檢測(cè)心肌細(xì)胞標(biāo)志物c-TnI、平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF表達(dá)情況。
　　3.采用Transwell模型檢測(cè)SDF-1α對(duì)CSCs遷移的影響及其可能機(jī)制。下室種植心肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染rAAV1-SDF1α-eGFP,上室為純化的CSCs。實(shí)驗(yàn)共分為四組,對(duì)照

9、組心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV1-eGFP,SDF-1α、AMD3100和LY294002組心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV1-SDF1α-eGFP;3天后CSCs加在上室中,AMD3100和LY294002組CSCs在遷移實(shí)驗(yàn)前分別與AMD3100(10μg/ml)和LY294002(20μmol/L)孵育1小時(shí)。24h后5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞。ELISA檢測(cè)上清SDF-1α的濃度。
　　4.左冠脈前降支(LAD)結(jié)扎建立小鼠心梗模型后,在梗死

10、區(qū)注射rAAV1-SDF1α-eGFP,在梗死區(qū)邊緣注射標(biāo)記的CSCs,觀察移植CSCs體內(nèi)歸巢及對(duì)心梗修復(fù)的影響。實(shí)驗(yàn)共分為6組:假手術(shù)組(sham組):開胸,不作其他處理;心梗組(MI組):結(jié)扎LAD制造心梗,但不作其它處理;空病毒對(duì)照組(empty組):結(jié)扎LAD,梗死區(qū)分5個(gè)點(diǎn)注射50μlrAAV1-eGFP空病毒,梗死周邊區(qū)分5個(gè)點(diǎn)注射50μlDAPI標(biāo)記的CSCs(含105細(xì)胞);SDF-1α組:結(jié)扎LAD,梗死區(qū)注射50μ

11、lrAAV1-SDF1α-eGFP病毒(1×1011vg),梗死周邊區(qū)注射CSCs;AMD3100組和LY294002組:同SDF-1α組,CSCs注入梗死周邊區(qū)前分別用AMD3100(10μg/ml)和LY294002(20μM)孵育1小時(shí)。21天后,頸脫臼處死小鼠,共聚焦熒光顯微鏡下檢測(cè)梗死周邊進(jìn)行干細(xì)胞注射的empty組、SDF-1α組、AMD3100組和LY294002組DAPI標(biāo)記的CSCs向梗死區(qū)遷移的情況,梗死區(qū)每個(gè)心臟標(biāo)

12、本隨機(jī)取10個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)遷移到梗死區(qū)的DAPI標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量。WB檢測(cè)心梗區(qū)SDF-1α表達(dá),各組WB條帶的OD值與sham組的OD值的比值作為各組的SDF-1α強(qiáng)度。
　　5.對(duì)心梗修復(fù)的影響采用TTC(triphenyltetrazoliumchloride,2,3,5—氯化三苯基四氮唑)染色法檢測(cè)進(jìn)行LAD結(jié)扎的empty組、MI組、SDF-1α組、AMD3100組和LY294002組的心肌梗死范圍。TTC染色后刀片分離

13、梗死區(qū)與非梗死區(qū),計(jì)算梗死區(qū)重量和心臟總重量的百分比作為梗死區(qū)的范圍。
　　6.歸巢到梗死區(qū)的CSCs分化情況采用免疫熒光檢測(cè)。檢測(cè)從周邊遷移到梗死區(qū)的DAPI標(biāo)記的CSCs體內(nèi)是否表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物c-TnI,每個(gè)心臟標(biāo)本,梗死區(qū)隨機(jī)取10個(gè)高倍視野,計(jì)算DAPI、c-TnI雙陽性與DAPI陽性細(xì)胞的比例,作為CSCs向梗死區(qū)遷移后向心肌系分化的百分比。
　　7.檢測(cè)CSCs體內(nèi)增殖情況。CSCs體外用BrdU標(biāo)記后注入

14、體內(nèi),腺相關(guān)病毒注射及CSCs移植方法同上。本實(shí)驗(yàn)分4組:Empty組、SDF-1α組、AMD3100組和LY294002組。21天后處死小鼠,免疫熒光檢測(cè)BrdU,DAPI染核。每個(gè)心臟標(biāo)本梗死區(qū)隨機(jī)取10個(gè)高倍視野,BrdU陽性細(xì)胞與DAPI陽性細(xì)胞的比例可以間接反應(yīng)遷移到梗死區(qū)的CSCs體內(nèi)增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.pSNAV2.0-SDF1α-EGFP質(zhì)粒,經(jīng)PCR、酶切可擴(kuò)增一約270bp的條帶,與SDF-1

15、αcDNA長(zhǎng)度一致,基因測(cè)序與目的基因序列完全一致,說明質(zhì)粒合成正確。重組腺相關(guān)病毒rAAV1-SDF1α-eGFP轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后免疫熒光可檢測(cè)到GFP和SDF-1α表達(dá),構(gòu)建成功。
　　2.酶消化聯(lián)合MACS可得到純度較高的c-kitCSCs,免疫熒光檢測(cè),膜表面c-kit為陽性,在體外可克隆擴(kuò)增。流式結(jié)果表明,MACS分選前,混合細(xì)胞中c-kit陽性細(xì)胞比例為8.31±0.35％,經(jīng)c-kit免疫磁珠純化后為97±4.51%,

16、c-kit/CXCR4雙陽性細(xì)胞比例分別為2.58±1.16%、4.54±1.79%和91.04±2.65%。這些CSCs基本都表達(dá)CXCR4。經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后,可表達(dá)c-TnI、α-SMA和vWF,說明c-kit心肌干細(xì)胞具有多向分化潛能。
　　3.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明,rAAV1-SDF1α-eGFP轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,可提高上清中2.CSCs成功體外培養(yǎng)、分離、擴(kuò)增,表達(dá)CXCR4,誘導(dǎo)分化后可表達(dá)心肌細(xì)胞、平滑肌