SDF-1α-CXCR4軸對心肌干細胞遷移及歸巢修復心肌的影響.pdf

1、背景與目的:
　　心肌梗死(myocardiuminfarction,MI)是由于冠狀動脈狹窄、閉塞導致心肌壞死后引起的一種嚴重危害人類健康的疾病,其最終結(jié)果往往會導致心力衰竭,目前藥物治療、內(nèi)科介入治療、外科冠狀動脈旁路搭橋術(shù)僅僅只能恢復局部心肌組織的血液供應,并不能從根本上修復已經(jīng)發(fā)生壞死的心肌組織。以往的觀念認為心臟是一個終末分化器官,當發(fā)生損傷時,心肌不能再生,僅能通過心肌肥大來進行代償。但是,近年來的研究表明,在成年個體

2、心臟內(nèi)存在有一群原始的心肌干細胞(cardiacstemcells,CSCs),可以分化為心肌、平滑肌、內(nèi)皮細胞,參與損傷修復,CSCs移植可以減少梗死面積,CSCs的發(fā)現(xiàn)為心肌損傷修復提供了新策略。研究表明,CSCs主要存在于心尖、心房等干細胞巢內(nèi),在心肌發(fā)生損傷時,CSCs如何動員及向損傷區(qū)域歸巢的機制尚不清楚。
　　基質(zhì)細胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor,SDF-1α)屬于CXC族趨化因子

3、成員,是生物體內(nèi)一種關(guān)鍵的細胞趨化因子。CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)是SDF-1α的受體,表達于多種干/祖細胞表面,可與SDF-1α耦合介導其遷移。我們及其他學者的研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血、血管內(nèi)膜損傷可上調(diào)SDF-1α的表達,介導多種干細胞歸巢新生血管、修復損傷內(nèi)皮。最近研究發(fā)現(xiàn)SDF-1α參與心梗后CSCs分化調(diào)控,可促進血管新生、減小心梗面積。但SDF-1α/CXCR4軸調(diào)控CSCs歸巢的作用及機制

4、有待進一步研究。
　　磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)蛋白家族是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,廣泛表達于多種組織與細胞中,參與細胞遷移、增殖、分化、凋亡、血管生成和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。多項實驗表明,PI3K參與SDF-1α/CXCR4調(diào)控的骨髓基質(zhì)干細胞、內(nèi)皮祖細胞、造血干細胞等多種干/祖細胞趨化作用及遷移。VEGF基因轉(zhuǎn)染可促進CSCs向心肌梗死區(qū)域歸巢,但PI3K/

5、Akt的抑制劑wortmannin可阻斷這一效應,這一結(jié)果表明,PI3K在CSCs的遷移、歸巢中發(fā)揮作用。我們前期的實驗及文獻報道表明,CSCs表面表達有CXCR4,CXCR4可通過激活PI3K途徑促進其他干/祖細胞遷移、歸巢,SDF-1α是否可以通過CXCR4/PI3K途徑介導CSCs的遷移、歸巢?
　　本課題觀察SDF-1α/CXCR4軸對CSCs體外遷移的影響,同時探討PI3K通路是否參與SDF-1α/CXCR4軸介導的CS

6、Cs遷移;采用心梗區(qū)注射SDF-1α基因聯(lián)合梗死周邊注射CSCs的方法,評價SDF-1α/CXCR4軸在CSCs歸巢及心肌再生中的作用,并探討PI3K通路在其中的作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建rAAV1-SDF1α-eGFP載體。根據(jù)基因序列合成SDF-1αcDNA,插入pSNAV2.0-mCMV-EGFP的SalⅠ和BglⅡ位點,即合成pSNAV2.0-SDF1α-EGFP質(zhì)粒。合成的質(zhì)粒通過酶切、PCR和測序鑒定。采用

7、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,pSNAV2.0-SDF1α-EGFP與輔助質(zhì)粒pAAV-R2C1、pHelper三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞,產(chǎn)生rAAV1-SDF1α-eGFP。將構(gòu)建的rAAV1-SDF1α-EGFP轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的心肌細胞,免疫熒光檢測GFP及心肌細胞內(nèi)SDF-1α表達情況,檢測重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　2.心臟酶消化培養(yǎng)聯(lián)合免疫磁珠分選(MACS)純化c-kit心肌干細胞,并作克隆培養(yǎng),免疫熒光檢測分選細胞表面c-kit表達情

8、況,流式細胞儀檢測MACS分選前后的細胞表面標志物c-kit和CD45或Sca-1或CXCR4的表達情況。c-kit心肌干細胞在分化誘導液中培養(yǎng)21天后,免疫熒光檢測心肌細胞標志物c-TnI、平滑肌細胞標志物α-SMA和內(nèi)皮細胞標志物vWF表達情況。
　　3.采用Transwell模型檢測SDF-1α對CSCs遷移的影響及其可能機制。下室種植心肌細胞,轉(zhuǎn)染rAAV1-SDF1α-eGFP,上室為純化的CSCs。實驗共分為四組,對照

9、組心肌細胞轉(zhuǎn)染rAAV1-eGFP,SDF-1α、AMD3100和LY294002組心肌細胞轉(zhuǎn)染rAAV1-SDF1α-eGFP;3天后CSCs加在上室中,AMD3100和LY294002組CSCs在遷移實驗前分別與AMD3100(10μg/ml)和LY294002(20μmol/L)孵育1小時。24h后5個高倍視野計數(shù)遷移的細胞。ELISA檢測上清SDF-1α的濃度。
　　4.左冠脈前降支(LAD)結(jié)扎建立小鼠心梗模型后,在梗死

10、區(qū)注射rAAV1-SDF1α-eGFP,在梗死區(qū)邊緣注射標記的CSCs,觀察移植CSCs體內(nèi)歸巢及對心梗修復的影響。實驗共分為6組:假手術(shù)組(sham組):開胸,不作其他處理;心梗組(MI組):結(jié)扎LAD制造心梗,但不作其它處理;空病毒對照組(empty組):結(jié)扎LAD,梗死區(qū)分5個點注射50μlrAAV1-eGFP空病毒,梗死周邊區(qū)分5個點注射50μlDAPI標記的CSCs(含105細胞);SDF-1α組:結(jié)扎LAD,梗死區(qū)注射50μ

11、lrAAV1-SDF1α-eGFP病毒(1×1011vg),梗死周邊區(qū)注射CSCs;AMD3100組和LY294002組:同SDF-1α組,CSCs注入梗死周邊區(qū)前分別用AMD3100(10μg/ml)和LY294002(20μM)孵育1小時。21天后,頸脫臼處死小鼠,共聚焦熒光顯微鏡下檢測梗死周邊進行干細胞注射的empty組、SDF-1α組、AMD3100組和LY294002組DAPI標記的CSCs向梗死區(qū)遷移的情況,梗死區(qū)每個心臟標

12、本隨機取10個高倍視野,計數(shù)遷移到梗死區(qū)的DAPI標記的細胞數(shù)量。WB檢測心梗區(qū)SDF-1α表達,各組WB條帶的OD值與sham組的OD值的比值作為各組的SDF-1α強度。
　　5.對心梗修復的影響采用TTC(triphenyltetrazoliumchloride,2,3,5—氯化三苯基四氮唑)染色法檢測進行LAD結(jié)扎的empty組、MI組、SDF-1α組、AMD3100組和LY294002組的心肌梗死范圍。TTC染色后刀片分離

13、梗死區(qū)與非梗死區(qū),計算梗死區(qū)重量和心臟總重量的百分比作為梗死區(qū)的范圍。
　　6.歸巢到梗死區(qū)的CSCs分化情況采用免疫熒光檢測。檢測從周邊遷移到梗死區(qū)的DAPI標記的CSCs體內(nèi)是否表達心肌特異性標志物c-TnI,每個心臟標本,梗死區(qū)隨機取10個高倍視野,計算DAPI、c-TnI雙陽性與DAPI陽性細胞的比例,作為CSCs向梗死區(qū)遷移后向心肌系分化的百分比。
　　7.檢測CSCs體內(nèi)增殖情況。CSCs體外用BrdU標記后注入

14、體內(nèi),腺相關(guān)病毒注射及CSCs移植方法同上。本實驗分4組:Empty組、SDF-1α組、AMD3100組和LY294002組。21天后處死小鼠,免疫熒光檢測BrdU,DAPI染核。每個心臟標本梗死區(qū)隨機取10個高倍視野,BrdU陽性細胞與DAPI陽性細胞的比例可以間接反應遷移到梗死區(qū)的CSCs體內(nèi)增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.pSNAV2.0-SDF1α-EGFP質(zhì)粒,經(jīng)PCR、酶切可擴增一約270bp的條帶,與SDF-1

15、αcDNA長度一致,基因測序與目的基因序列完全一致,說明質(zhì)粒合成正確。重組腺相關(guān)病毒rAAV1-SDF1α-eGFP轉(zhuǎn)染心肌細胞后免疫熒光可檢測到GFP和SDF-1α表達,構(gòu)建成功。
　　2.酶消化聯(lián)合MACS可得到純度較高的c-kitCSCs,免疫熒光檢測,膜表面c-kit為陽性,在體外可克隆擴增。流式結(jié)果表明,MACS分選前,混合細胞中c-kit陽性細胞比例為8.31±0.35％,經(jīng)c-kit免疫磁珠純化后為97±4.51%,

16、c-kit/CXCR4雙陽性細胞比例分別為2.58±1.16%、4.54±1.79%和91.04±2.65%。這些CSCs基本都表達CXCR4。經(jīng)分化誘導培養(yǎng)21天后,可表達c-TnI、α-SMA和vWF,說明c-kit心肌干細胞具有多向分化潛能。
　　3.Transwell遷移實驗表明,rAAV1-SDF1α-eGFP轉(zhuǎn)染心肌細胞,可提高上清中2.CSCs成功體外培養(yǎng)、分離、擴增,表達CXCR4,誘導分化后可表達心肌細胞、平滑肌