MAPK家族在異氟烷大鼠心肌預(yù)處理延遲相保護(hù)中的作用及機(jī)制.pdf

1、本文研究目的：采用Langendorff離體大鼠心臟灌注模型，內(nèi)容共分兩部分： 第一部分：研究不同濃度異氟烷延遲預(yù)處理(isonurane induced delayed preconditioning，IsoP)對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，探討異氟烷延遲預(yù)處理的最適濃度和最佳間隔時(shí)間。 第二部分觀察ERK、p38MAPK、JNK在異氟烷預(yù)處理后缺血再灌注心肌的表達(dá)及作用，并應(yīng)用ERK、p38MAPK、JNK特異

2、性抑制劑觀察其是否可拮抗或模擬異氟烷預(yù)處理效應(yīng)；應(yīng)用RT-PCR方法，觀察三個(gè)激酶的下游底物c-fosmRNA、c-jmn mRNA、HSP27 mRNA的含量變化，進(jìn)一步探討MAPK家族在異氟烷大鼠心肌預(yù)處理延遲相保護(hù)中的作用及機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)材料： 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 成年Sprague．Dawley(SD)大鼠，體重250～300克，清潔級(jí)，雌雄不限。由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 二、實(shí)驗(yàn)試劑：

3、氯化鈣(AR)(徐州化學(xué)試劑二廠)葡萄糖(AR)(上海虹光化工廠)氯化鉀(AR)(江蘇第一化工廠)碳酸氫鈉(AR)(上海虹光化工廠)氯化鈉(AR)(上海虹光化工廠)磷酸二氫鉀(AR)(上海化學(xué)試劑二廠)硫酸鎂(AR)(連云港化學(xué)試劑廠)乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(AR)(南京化學(xué)試劑廠)異氟烷(美國雅培公司)TTC(氯化三苯基四氮唑)(Sigma公司)CK測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)LDH測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)p

4、-JNK抗體(G-7)：sc-6254(Santa Cruz Biotechnology，Inc)p-ERK抗體(E-4)：so-7383(Santa Cruz Biotechnology，Inc)p-p38MAPK抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)JNK抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)ERK抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)p3 8MAPK抗體

5、(Santa Cruz Biotechnology，Inc)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、異氟烷延遲預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響104只SD大鼠隨機(jī)分為13組，每組8只。對(duì)照組(control)：大鼠不作任何處理，直接應(yīng)用Langendor罐注系統(tǒng)復(fù)制離體全心心肌缺血常溫再灌注損傷模型，缺血30 min，再灌注120 min；吸氧預(yù)處理間隔24 h組(O<,2>24h)、吸氧預(yù)處理間隔48 h組(O<,2>48h)、吸氧預(yù)處理

6、間隔72 h組(O<,2>72 h)，此3組大鼠均先吸純氧2 h；0.75MAC異氟烷預(yù)處理間隔24 h組(0.75Is024 h)、0.75MAC異氟烷預(yù)處理間隔48 h組(0.75Iso48 h)、0.75MAC異氟烷預(yù)處理間隔72 h組(0.75Iso72 h)，此3組大鼠均先吸入和氧氣混合的0.75MAC異氟烷2 h；1.0MAC異氟烷預(yù)處理間隔24 h組(1.0Iso24 h)、1.0MAC異氟烷預(yù)處理間隔48 h組(1.0I

7、so48 h)、1.0MAC異氟烷預(yù)處理間隔72 h組(1.0Iso72 h)，此3組大鼠吸入和氧氣混合的1.0MAC異氟烷2 h。 二、MAPK家族在異氟烷大鼠心肌預(yù)處理延遲相保護(hù)中的作用及機(jī)制根據(jù)第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)1.5MAC異氟烷預(yù)處理間隔48h的心肌保護(hù)作用最好。56只大鼠隨機(jī)分為7組，每組8只。對(duì)照組(contr01)、1.5MAC異氟烷預(yù)處理間隔48 h組(1.5Iso48 h)處置同第一部分。DMSO+1.5

8、MAC異氟烷預(yù)處理間隔48h組(DM組)、PD98059+1.5MAC異氟烷預(yù)處理間隔48h組(PD組)、SB203580+1.5MAC異氟烷預(yù)處理間隔48h組(SB組)、SP600125+1.5MAC異氟烷預(yù)處理間隔48h組(SP+1.5Iso48h組)、SP600125+control組(SP+con組)，以上5組在缺血前45min分別腹腔注射10％DMSO 1ml、ERK抑制劑PD98059 0.5mg/kg、p38MAPK抑制劑

9、SB203580 1mg/kg、JNK抑制劑 SP600125 20mg/kg和SP60012520mg/kg。以后的模型制備、檢測方法、檢測指標(biāo)同第一部分。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 第一部分： 各組平衡末及缺血后即刻的各種心功能指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。異氟烷預(yù)處理各組復(fù)灌后各時(shí)間點(diǎn)的LVEDP均顯著低于control組和O<,2>預(yù)處理組(P<0.05，P<0.01)，再灌注3min、5min時(shí)，1.5Iso48

10、h組LVEDP明顯低于0.75Iso異氟烷預(yù)處理各組(P<0.05)；異氟烷預(yù)處理各組LVDP的恢復(fù)百分比均高于control組和O<,2>預(yù)處理組，其中復(fù)灌30min時(shí)，1.5Iso48h組LVDP的恢復(fù)百分比是63％，明顯高于control組(39％)。1.0MAC異氟烷預(yù)處理各組和1.5MAC異氟烷預(yù)處理各組+dp/dt<,max>在復(fù)灌20min、30min、45min的恢復(fù)百分比高于control組(P<0.05，P<0.01

11、)；1.5Iso48h組+dp/dt<,max>在復(fù)灌60min、90min、120min的恢復(fù)百分比仍明顯高于control組(P<0.01)，且在20min、30min、45min的恢復(fù)百分比高于O<,2>預(yù)處理組(P<0.05，P<0.01)；復(fù)灌30 min、45 min、60 min、90 min、120 min，1.5Iso48h組-dp/dt<,max>的恢復(fù)值顯著高于control組、氧氣預(yù)處理組、0.75MAC異氟烷預(yù)

12、處理組(P<0.05，P<0.01)；并在復(fù)灌20 min、30 min時(shí)高于1.0Iso24h組(P<0.05)，復(fù)灌20min時(shí)高于1.0Iso72h組(P<0.05)； 1.5Iso48h組復(fù)灌20min、30min、45min、60min、90min、120min時(shí)的心率明顯高于control組和O<,2>預(yù)處理組(P<0.05，P<0.01)。 第二部分： 1、ERK抑制劑PD98059組(PD組)與1.5Is

13、o48h組比較，心功能各項(xiàng)指標(biāo)均明顯惡化，CK、LDH的釋放量明顯增加，心梗面積顯著增加(P<0.05，P<0.01)，PD98059部分逆轉(zhuǎn)了異氟烷預(yù)處理的延遲相心肌保護(hù)效應(yīng)。免疫組織化學(xué)染色顯示：control組未見ERK磷酸化和核轉(zhuǎn)位的陽性細(xì)胞，1.5Iso48h組ERK出現(xiàn)明顯的活化特征，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，表現(xiàn)為：棕褐色陽性顆粒較彌散地分布于心肌細(xì)胞胞漿和濃集于胞核。PD98059明顯抑制了ERK磷酸化和核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。Westembl

14、ot半定量分析顯示1.5Iso48h組p-ERK1/2的表達(dá)量明顯高于comrol組(P<0.01)，PD98059顯著抑制了p-ERK1/2的表達(dá)(P<0.01，versus 1.5Iso48h組)；RT-PCR結(jié)果顯示：1.5Iso48h組c-fos mRNA含量顯著升高(P<0.01，versus control組)；PD98059使c-fos mRNA含量顯著減少(vsl.5Iso48h組，P<0.01)。 2、p38M

15、APK抑制劑SB203580組(SB組)與1.5Iso48h組比較，心功能各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)比均顯著降低，CK、LDH的釋放量明顯增加，心梗面積顯著增加(P<0.05，P<0.01)，SB203580部分逆轉(zhuǎn)了異氟烷預(yù)處理的延遲相心肌保護(hù)效應(yīng)。免疫組織化學(xué)染色顯示：control組未見p38MAPK磷酸化和核轉(zhuǎn)位的陽性細(xì)胞，1.5Iso48h組p38MAPK出現(xiàn)明顯的活化特征，并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，表現(xiàn)為：棕褐色陽性顆粒較彌散地分布于心肌細(xì)胞胞漿和濃

16、集于胞核。SB203580明顯抑制了p38MAPK磷酸化和核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。Westemblot半定量分析1.5Is048h組p38MAPK的表達(dá)量明顯高于comrol組(P<0.01)，SB203580顯著抑制了p-p38MAPK的表達(dá)(P<0.01，versus 1.5Iso48h組)；RT-PCR結(jié)果顯示：1.5Iso48h組HSP27 mRNA含量顯著升高(P<0.01，versus control組)；SB203580使HSP27

17、mRNA含量顯著減少(vsl.5Iso48h組，P<0.01)。 研究結(jié)論： 1、異氟烷預(yù)處理的延遲心臟保護(hù)作用是劑量依賴性的，且與間隔時(shí)間有關(guān)，1.5MAC異氟烷預(yù)處理間隔48h的心臟保護(hù)作用最強(qiáng)。 2、異氟烷預(yù)處理可以激活ERK和p38MAPK、抑制JNK的活性。 3、ERK、p38MAPK可能作為介導(dǎo)子參與異氟烷心肌延遲預(yù)處理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制JMK激活可能也是異氟烷心肌延遲預(yù)處理的重要機(jī)制之一。