穩(wěn)定表達EGFR細胞系的建立及其抗EGFR單鏈抗體的篩選與鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分 穩(wěn)定表達EGFR-GFP融合蛋白細胞系的建立 目的建立膜表面穩(wěn)定表達EGFR-GFP融合蛋白的細胞系,為后續(xù)研究奠定基礎。 方法采用CaCl2法將pEGFR-EGFP質粒轉化大腸桿菌DH5α,酶切鑒定后提取質粒經電穿孔轉染CHO-K1細胞;以EGFP作為熒光報告分子,克隆化培養(yǎng)以獲取單克隆陽性細胞;流式細胞術、熒光顯微鏡術、WesternBlot檢測轉染細胞EGFR-GFP融合蛋白的表達;反復凍存、復蘇

2、、傳代鑒定細胞表達EGFR-GFP融合蛋白的穩(wěn)定性。 結果①轉染后,經G418篩選14天,克隆化培養(yǎng),共獲得2株穩(wěn)定轉染的單克隆細胞,分別命名為CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2②經流式細胞儀檢測,CHO-EGFR-GFP1細胞GFP、PE雙標記陽性率達92%以上,說明EGFR-GFP融合蛋白主要表達于細胞膜上,CHO-EGFR-GFP2細胞GFP檢測陽性率較高,但PE標記陽性率較低,提示融合蛋白主要表達于細

3、胞內;⑧倒置相差熒光顯微鏡觀察可見CHO-EGFR-EGFP1主要表現(xiàn)為細胞膜綠色熒光,能與PE標記的anti-human-EGFR結合,CHO-EGFR-EGFP2細胞主要呈現(xiàn)細胞內綠色熒光,不與PE標記的anti-human-EGFR結合,與流式細胞儀檢測結果一致;④Westernblot分析CHO-EGFR-GFP1細胞裂解液可見分子量約166kDa條帶;⑤CHO-EGFR-EGFP1細胞經反復凍存、復蘇,證明EGFR-GFP融合

4、蛋白能穩(wěn)定表達,表明成功建立穩(wěn)定表達EGFR-GFP融合蛋白的細胞系,為研究EGFR與其配體間相互作用以及篩選靶向EGFR的單鏈抗體奠定了基礎。 第二部分 EGF對CHO-EGFR-GFP1細胞生物學特性的影響 目的對于大多數(shù)細胞而言,EGFR與其配體EGF相互作用往往促進其增殖,但對于某些細胞,EGF且相反地抑制其增殖。本部分研究擬以所建立的膜表面表達全長EGFR與GFP融合蛋白的細胞系CHO-EGFR-GFP

5、1為模型,進一步研究EGF與EGFR之間相互作用。 方法通過細胞計數(shù),繪制生長曲線,比較穩(wěn)定轉染細胞及未轉染細胞的生長情況;臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)觀察不同濃度EGF刺激48h后細胞增殖情況;PI染色一步法流式細胞儀檢測不同濃度EGF刺激48h和100ng/mlEGF刺激不同時間細胞周期改變以及細胞凋亡情況,Hoechst33258染色觀察細胞凋亡情況;流式細胞術測定GFP平均熒光強度、Westernblot檢測及倒置熒光顯微鏡觀

6、察判定EGFR表達水平的變化。 結果以建立的膜表面表達全長EGFR與GFP融合蛋白的細胞系CHO-EGFR-GFP1為細胞模型,研究EGF與EGFR之間的相互作用。研究結果表明:①在不加入EGF的培養(yǎng)體系中,CHO-EGFR-GFP1、CHO-EGFR-GFP2細胞與未轉染CHO-K1細胞生長特性無顯著差異,在保證培養(yǎng)條件、接種細胞數(shù)、觀察時間基本一致的情況下,各細胞增殖速度接近,說明表達的融合蛋白對細胞沒有明顯毒性;②在培養(yǎng)體

7、系中,加入低濃度的EGF可促進CHO-EGFR-GFP1細胞增殖,而在高濃度EGF培養(yǎng)體系中則引起CHO-EGFR-GFP1細胞失去粘附、細胞周期阻滯、促進細胞凋亡以及抑制細胞增殖;③EGF對細胞增殖的影響與EGFR表達水平密切相關,高濃度EGF以一種劑量依賴性的方式同時上調EGFR的表達和引起細胞凋亡;④EGF刺激對CHO-K1及CHO-EGFR-GFP2細胞生長無明顯作用。 第三部分 EGFR特異性內吞性單鏈抗體的篩

8、選與鑒定 目的利用抗體將治療分子(毒素、治療基因)直接運送到腫瘤細胞內發(fā)揮作用是一種重要的腫瘤靶向治療策略。本研究擬從大型人源抗體庫Griffin1中直接篩選出靶向EGFR并能夠觸發(fā)其內吞的單鏈抗體,為研究靶向EGFR的抗腫瘤治療藥物奠定基礎。 方法以穩(wěn)定轉染的CHO-EGFR-GFP1細胞和未轉染的CHO-K1細胞分別作為陽性和陰性細胞,采用負篩選的方法,洗去與細胞表面結合的噬菌體,裂解細胞獲取內吞性的噬菌體用于下一輪

9、篩選;通過比較每輪投入及洗脫出噬菌體的效價比以及細胞ELISA檢測多克隆p-scFv與陽性、陰性細胞結合情況對篩選過程進行監(jiān)測;采用菌落PCR挑選含有全長scFv片斷的菌落,進一步用FCM檢測單克隆p-scFv與天然表達EGFR細胞及EGFR陰性細胞結合情況;挑選EGFR特異性單克隆p-scFv采用DNA測序法確定克隆多樣性;原核表達EGFR特異性s-scFv采用FCM檢測其與天然表達EGFR細胞及EGFR陰性細胞結合百分率,采用Wes

10、ternblot檢測其與EGFR陽性細胞及陰性細胞裂解液結合的差異,倒置熒光顯微鏡觀察s-scFv是否被內吞入EGFR陽性細胞。 結果經過5輪篩選,細胞裂解液中洗脫出噬菌體效價有500倍以上提高,而細胞表面結合噬菌體效價僅有15倍增長,說明內吞性p-scFv得到富集;細胞ELISA結果顯示多克隆p-scFv與CHO-EGFR-GFP1細胞和CHO-K1細胞均有明顯結合,但與前者結合高于后者,說明所獲多克隆p-scFv大多數(shù)針對兩

11、種細胞表面共同抗原,但有部分特異性結合EGFR;菌落PCR顯示約45%克隆中含有完整的1kbscFv片斷;共挑取300個菌落,經菌落PCR、細胞ELISA、FCM檢測,共得到4株EGFR特異性scFv,DNA測序結果顯示4株DNA序列僅一株有個別堿基不同,但均能翻譯成同樣的氨基酸系列,因此將其統(tǒng)一命名為F4-scFv,F(xiàn)4-scFv可與天然表達EGFR的細胞特異性結合并能觸發(fā)受體介導的內吞作用,但不與EGFR陰性細胞結合;Western

12、blot檢測F4-scFv可識別EGFR特異性條帶。F4-scFv可被用作載體運送治療藥物進入腫瘤細胞,而且由于其人源性,對人將無免疫原性。在篩選和鑒定過程中采用表達GFP標記的受體的轉染細胞作為陽性細胞,不用表達、純化受體蛋白用于篩選和檢測,可保證所篩選的抗體能與天然受體結合,加快了獲取靶向抗體的進程。 結論成功建立膜表面穩(wěn)定表達EGFR-GFP的細胞系CHO-EGFR-GFP1;首次在同一種因不同濃度EGF刺激而表達不同水平

13、EGFR的細胞中觀察到EGF對細胞增殖的影響與EGFR表達水平的關系。高濃度EGF刺激引起腫瘤細胞失去粘附可能是導致腫瘤細胞容易脫落,發(fā)生轉移的機制之一;進一步以CHO-EGFR-GFP1為陽性細胞,未轉染CHO-K1細胞為陰性細胞,采用負篩選方法,從大型人源抗體庫中篩選得到EGFR特異性能夠觸發(fā)受體內吞的單鏈抗體F4-scFv,F(xiàn)4-scFv可用于運載治療性物質進入高表達EGFR的腫瘤細胞,為進一步研究靶向EGFR的抗腫瘤治療藥物奠定

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