乳腺癌骨轉(zhuǎn)移早期事件的探討.pdf

1、背景：乳腺癌是女性中常見(jiàn)的惡性腫瘤。骨骼是乳腺癌常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一，高達(dá)70-80％的乳腺癌可發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。由于骨轉(zhuǎn)移可以引起病理性骨折和劇烈的骨痛，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，而常規(guī)化、放療和手術(shù)又不能延長(zhǎng)晚期乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的生存期，因此，深入研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)制，特別是骨轉(zhuǎn)移早期的分子機(jī)制對(duì)于早期診斷并綜合各種手段有效控制骨痛和減少骨相關(guān)事件的發(fā)生，有著重要的臨床意義。 目前乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的確切分子機(jī)制還不清楚。

2、當(dāng)前研究認(rèn)為骨干骺端血管結(jié)構(gòu)與腫瘤細(xì)胞的粘附、腫瘤細(xì)胞向血管外浸潤(rùn)與骨基質(zhì)的粘附、腫瘤細(xì)胞與骨細(xì)胞及骨髓微環(huán)境的交互作用等方面在骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起著重要的作用。但由于缺乏合適的動(dòng)物模型和骨組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使腫瘤特異性骨轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究受限。 隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)不僅參與支配局部組織的生理活動(dòng)，它還可以通過(guò)與細(xì)胞膜表面的特異性受體結(jié)合進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而對(duì)靶細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、代謝、細(xì)胞骨

3、架結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)產(chǎn)生影響。其中，神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)腫瘤增殖和分化的調(diào)控作用、調(diào)控機(jī)理及腫瘤細(xì)胞表面神經(jīng)肽受體的表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系正日益受到研究者的注意。為此，本課題研究了前速激肽原(preprotachykinin-I，PPT-I)及速激肽受體NK-1和NK-2在乳腺癌中的表達(dá)及其在乳腺癌增殖中的作用，并初步探討了它們?cè)谌橄侔┕寝D(zhuǎn)移早期事件中的可能作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，進(jìn)而為骨轉(zhuǎn)移的預(yù)防、早期診斷以及

4、制定合理有效的綜合治療方案提供重要的理論依據(jù)。 第一部分：PPT-I、NK-1和NK-2在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)目的：研究PPT-I、NK-1和NK-2在乳腺癌及其癌旁組織以及乳腺癌細(xì)胞系T-47D、MCF-7和正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100中的表達(dá)，探討PPT-I、NK-1和NK2的表達(dá)與乳腺癌的惡性生物學(xué)行為之間的關(guān)系。 方法：首先通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)了37例乳腺癌及其癌旁組織以及乳腺癌細(xì)胞系T-47D、

5、MCF-7和正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100的PPT-I、NK-1和NK-2的表達(dá)。然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞系T-47D，MCF-7，MDA-MB-435，以及正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100的PPT-I、NK-1和NK-2的mRNA和蛋白表達(dá)。 結(jié)果：乳腺癌組織NK-1、NK-2和PPT-I的陽(yáng)性表達(dá)率分別為83.8％、81.1％和86.5％，而癌旁組織三個(gè)指標(biāo)的表達(dá)率分別為18.8％

6、、75％和21.9％，兩者比較乳腺癌組織的NK-1和PPT-I的表達(dá)率明顯高于癌旁組織(p＜0.01)，而NK-2的表達(dá)兩者差別不大。PPT-I和NK-1在3個(gè)乳腺癌細(xì)胞系呈高表達(dá)，在正常乳腺上皮細(xì)胞HBL-100中呈低表達(dá)，而NK-2表達(dá)在幾個(gè)細(xì)胞系中沒(méi)有明顯差異。 結(jié)論：PPT-I和NK-1的表達(dá)可能與乳腺癌的惡性增殖和浸潤(rùn)能力有關(guān)。 第二部分：NK-1和NK-2受體拮抗劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞系T-47D的增殖的影響目的：通

7、過(guò)研究NK-1和NK-2受體拮抗劑對(duì)于乳腺癌細(xì)胞系T-47D增殖的影響，進(jìn)一步探討速激肽生物網(wǎng)絡(luò)在乳腺癌惡性增殖中的重要作用。 方法：將乳腺癌細(xì)胞系T-47D分為四個(gè)組，即空白對(duì)照組、NK-1受體拮抗劑組、NK-2受體拮抗劑組和NK-1、NK2受體拮抗劑聯(lián)合用藥組，分別采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞生長(zhǎng)周期檢測(cè)的方法，觀察用藥后四個(gè)組的細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果：加入NK受體拮抗劑后，乳腺癌細(xì)胞的克隆形成被明顯地抑制，但在同時(shí)加入兩種

8、拮抗劑的實(shí)驗(yàn)組并沒(méi)有完全阻斷其增殖，仍然看到了乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這提示我們?nèi)橄侔┘?xì)胞可能還同時(shí)存在其它的途徑促進(jìn)其生長(zhǎng)。同時(shí)我們通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞增殖周期的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，加入拮抗劑后，大量細(xì)胞被阻滯在了S期和G0/G1期，而沒(méi)有進(jìn)入G2/M期進(jìn)行分裂增殖。 結(jié)論：速激肽受體NK-1和NK-2在乳腺癌細(xì)胞系T-47D生長(zhǎng)中的具有重要作用，提示乳腺癌細(xì)胞可能存在速激肽的自分泌和旁分泌作用，通過(guò)這些作用可以促進(jìn)自身的增殖。 第

9、三部分PPT-I、NK-1和NK-2的表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移之間相互關(guān)系的探討目的：探討PPT-I基因、速激肽受體NK-1和NK-2的表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移之間可能存在的相關(guān)關(guān)系。 方法：將乳腺癌細(xì)胞系T-47D與正常成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)等量混合培養(yǎng)，分別在混合培養(yǎng)后48小時(shí)和96小時(shí)，采用免疫磁珠陽(yáng)性分選的方法，從共培養(yǎng)體系中分離出T-47D細(xì)胞，分別采用realtime-PCR檢測(cè)混合前后T-47D細(xì)胞PPT-I、NK-1

10、和NK-2的mRNA表達(dá)變化；western-blot檢測(cè)混合前后T-47D細(xì)胞PPT-I、NK-1和NK-2的蛋白表達(dá)的變化；利用透射電鏡觀察混合前后T-47D超微結(jié)構(gòu)的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)T-47D增殖周期的變化；以及混合培養(yǎng)后T-47D細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線的變化。 結(jié)果：與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)后T-47D細(xì)胞的增殖明顯減慢，細(xì)胞周期也發(fā)生了改變，大量細(xì)胞被阻滯在了S期，而沒(méi)有進(jìn)入G2/M期進(jìn)行分裂增殖，類似于一種接觸性抑制的

11、狀態(tài)。電鏡超微結(jié)構(gòu)的觀察也證實(shí)了混合培養(yǎng)后T-47D細(xì)胞遺傳物質(zhì)合成的增加，但同時(shí)卻出現(xiàn)了大量糖原顆粒的堆積，提示我們混合后T-47D細(xì)胞的增殖受到明顯抑制。與MSC混合培養(yǎng)96小時(shí)后，T-47D細(xì)胞的PPT-I的蛋白及mRNA表達(dá)明顯發(fā)生了上調(diào)，而NK-1和NK-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降。 結(jié)論：乳腺癌細(xì)胞在骨轉(zhuǎn)移早期很可能是通過(guò)前速激肽原基因PPT-I的表達(dá)上調(diào)而獲得在骨髓基質(zhì)中的生存，同時(shí)它所表現(xiàn)的接觸性抑制的狀態(tài)很