31352.β半乳糖苷酶基因tt412的原核表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究及分子改造

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文β半乳糖苷酶基因tt412的原核表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究及分子改造姓名：張晨婷申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：劉玉煥20090606中山大學(xué)碩士學(xué)位論文乳糖酶基因tt412的表達(dá)產(chǎn)物約為773kDa該酶最適反應(yīng)溫度為46℃，在5660℃下處理2min，幾乎檢測(cè)不到酶活力，表明該酶熱穩(wěn)定性較差：在pH70，即天然牛乳的pH值，該酶水解活力最高，在pH69之間酶活力維持在80％以上：Na、K、Zn2、Mn2、M92、

2、Fe2對(duì)酶活性影響不大，Cu2對(duì)酶活力有較強(qiáng)的抑制作用：在O30mM濃度范圍內(nèi)，Ca2幾乎不影響酶的活性。以O(shè)NPG為底物，‰值為0567nmol／L，‰x值為8834nmol／mim以乳糖為底物，‰值為9443nmol／L，‰。值為3125nmol／min。盡管乳糖酶基因tt412在原核表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，并且以O(shè)NPG為底物時(shí)其酶活性高達(dá)106U／ml；可是以乳糖為底物時(shí)酶活性只有097U／nll，這給它在食品工業(yè)中的應(yīng)用帶來(lái)

3、了困難。為了提高乳糖酶TT412對(duì)乳糖的降解能力，我們對(duì)克隆的乳糖酶基因tt412進(jìn)行分子改造。通過(guò)同源建模分析，在基因上選取了三個(gè)與酶活性相關(guān)的位點(diǎn)(0282、W316、TLNV42)進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后對(duì)突變子進(jìn)行酶活性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在D282位點(diǎn)的三種不同氨基酸突變都沒(méi)有產(chǎn)生可溶性的酶蛋白；在W316位點(diǎn)的三種不同氨基酸突變酶的活性反而比野生型的低：只有在TLNV42位點(diǎn)發(fā)生突變的酶活力明顯提高，以乳糖為底物的酶活性提高了47