豬胚胎干細(xì)胞（EG）建系影響因素的研究.pdf

1、1.該實驗以中國近交系五指山小型豬(WZSP)和微型白豬為材料,先后從27頭豬采集了312枚早期胎兒用于進行豬胚胎干細(xì)胞(EG)建系影響因素研究,得出如下結(jié)論:(1)d26-28豬胎兒可用于制作胎兒成纖維細(xì)胞.制作飼養(yǎng)層時,STO、MEF<'1>細(xì)胞用10μg/mL絲裂酶素C處理1.75h~2h;PEF細(xì)胞用絲裂酶素C處理2.25h~2.5h.(2)分別收集d27 WZSP和微型白豬胎兒,實驗結(jié)果證明,WZSP和微型白豬在EG細(xì)胞培養(yǎng)方

2、面沒有顯著性差異(P>0.05),都可以用來作為EG細(xì)胞建系的材料.(3)分別采用d26、d27、d28胎兒,在相同條件下培養(yǎng),實驗結(jié)果證明,d26、d27、d28胎兒PGC細(xì)胞培養(yǎng)效果差異不顯著(P>0.05).(4)采集d27胚胎,分別放在兩種培養(yǎng)液中培養(yǎng)[培養(yǎng)液1:DMEM(丙酮酸鈉)+15％FCS+1％L-谷氨酰胺+1％MEM-非必需氨基酸+1％Penicillin-Streptomycin+10μMβ-巰基乙醇;培養(yǎng)液2:DM

3、EM(丙酮酸鈉):HF10(v:v=50:50)+15％FCS+1％L-谷氨酰胺+1％MEM-非必需氨基酸+1％Penicillin-Streptomycin+10μMβ-巰基乙醇+1000IU/mL LIF+40ng/mL SCF+20ng/mL bFGF],結(jié)果證明兩種培養(yǎng)液培養(yǎng)PGC細(xì)胞效果差異不顯著(P>0.05).(5)用不同飼養(yǎng)層培養(yǎng)PGC,實驗結(jié)果證明PGC在新鮮制作的STO和MEF<'1>飼養(yǎng)層上,可以得到傳3代以上的E

4、G集落;PGC在鋪有解凍的STO飼養(yǎng)層細(xì)胞、PEF或絲裂霉素C處理過的PEF、涂有0.1％明膠的4孔板上,一直沒有得到典型的EG集落.(6)用兩種方法從生殖嵴獲得PGC細(xì)胞:a,機械分離;b,化學(xué)消化+機械分離.結(jié)果證明兩種PGC采集方式培養(yǎng)效果沒有顯著差異(P>0.05);比較了一個胎兒的PGC接種1、2、3、4個培養(yǎng)孔(4孔板),結(jié)果證明接種密度以1個胎兒接種2-3個培養(yǎng)孔的密度比較合適.(7)對非飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)豬PGC進行了初

5、步探索.實驗結(jié)果證明,以STO為飼養(yǎng)層,培養(yǎng)液中加條件培養(yǎng)基對豬EG細(xì)胞保持不分化狀態(tài)有積極作用,但培養(yǎng)板底鋪有STO基質(zhì)或明膠,即使用條件培養(yǎng)基也沒有獲得典型的EG集落.(8)以STO細(xì)胞為飼養(yǎng)層,培養(yǎng)液中加否生長因子對EG培養(yǎng)效果影響不大(P>0.05),但培養(yǎng)液中加入生長因子后,對EG細(xì)胞培養(yǎng)傳代更有利.而培養(yǎng)板底只鋪有0.1％的明膠時,即使培養(yǎng)液中加入生長因子也沒有形成典型的EG集落.(9)對原代出現(xiàn)的EG集落分別在不同時間傳代

6、,實驗結(jié)果證明,在原代出現(xiàn)大批EG集落的(以出現(xiàn)大批EG集落的當(dāng)天為第1天,d1)第2(d2)、3(d3)、4(d4)天傳代效果好;對原代出現(xiàn)的EG集落分別采用三種消化方式傳代:a,消化液1(0.2％Trypsion-0.04％EDTA)+一次離散法;b,消化液2(含0.1％雞血清的消化液1)+一次離散法;c,消化液2+連續(xù)離散法.實驗結(jié)果證明,用a、b、c三種方式傳代原代EG集落后都能形成新的大量EG集落.2.將新鮮和培養(yǎng)24h的PG