新城疫病毒TS09-C株反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建及其初步應(yīng)用.pdf

1、在現(xiàn)今的養(yǎng)禽業(yè)中，新城疫病毒(NDV，Newcastle Disease Virus)引起的新城疫(ND，Newcastle Disease)作為一種高傳染性疾病，依然廣泛地存在于世界各地。對(duì)其的防控手段主要以疫苗接種為主。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，基因工程疫苗脫穎而出。其中重組NDV活載體疫苗以其穩(wěn)定性、高滴度生長(zhǎng)特性、免疫范圍廣、免疫手段多樣性等等優(yōu)勢(shì)，成為最具發(fā)展?jié)摿Φ囊呙纭１狙芯恳孕逻x育純化的、適應(yīng)BHK-21細(xì)胞的耐熱株TS0

2、9-C株為對(duì)象，利用反向遺傳技術(shù)，拯救出重組新城疫病毒耐熱株。重組病毒生物學(xué)特性結(jié)果表明，重組株保留了親本株的耐熱性、低致病力和高滴度生長(zhǎng)特性。這意味著首個(gè)NDV耐熱株的反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立。在該系統(tǒng)建立的基礎(chǔ)上，成功獲得了插入有外源綠色熒光蛋白基因的重組耐熱病毒。為之后插入其他病毒的免疫原性基因，多價(jià)苗的研制打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)也為耐熱機(jī)理的研究創(chuàng)造平臺(tái)。
　　 1.新城疫病毒TS09-C株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立。

3、>　　 在本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建TS09-C株全長(zhǎng)cDNA的基礎(chǔ)上，以全長(zhǎng)質(zhì)粒pBR-TS09-C為模板，擴(kuò)增NP、P和L的全基因片段并分別克隆于質(zhì)粒pVAX上，成功構(gòu)建出3個(gè)輔助質(zhì)粒pVAX-NP、pVAX-P、pVAX-L。以磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將全長(zhǎng)質(zhì)粒pBR-TS09-C與輔助質(zhì)粒pVAX-NP、pVAX-P、pVAX-L共轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞預(yù)孵育表達(dá)T7 RNA聚合酶的痘病毒，收獲培養(yǎng)物上清，分別接種BHK-21細(xì)胞、9日

4、齡SPF雞胚尿囊腔;培養(yǎng)3-5d，收獲細(xì)胞上清、雞胚尿囊液后，以Real-time PCR、HA、IFA、電鏡、SDS-PAGE等方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示重組病毒拯救成功，同時(shí)標(biāo)志著NDV耐熱株反向遺傳操作系統(tǒng)建立。
　　 2.重組新城疫病毒(rTS09-C)生物學(xué)特性的研究。
　　 拯救出的重組新城疫病毒(rTS09-C)致病力檢測(cè)包括ICH、IVPI、MDT3個(gè)方面。其結(jié)果為:ICPI為0、IVPI為0、MDT值＞15

5、0h。由此結(jié)果可得出rTS09-C株保留了TS09-C株弱毒低致病力的特性。對(duì)rTS09-C株的細(xì)胞、雞胚增殖滴度和血凝效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，rTS09-C株的細(xì)胞增殖滴度為107TCID50/mL，雞胚增殖滴度為107.5EID50/mL，血凝效價(jià)為27，均與親本株相似。rTS09-C株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明rTS09-C無(wú)論在細(xì)胞水平上，還是在雞胚水平上的生長(zhǎng)曲線整體趨勢(shì)均與TS09-C株相近，即rTS09-C株保留了TS09-C株的高滴度

6、生長(zhǎng)特性。
　　 對(duì)rTS09-C株的耐熱性進(jìn)行測(cè)試，與TS09-C株、Lasota株進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，Lasota株56℃水浴作用9min后即失去血凝活性，而TS09-C株可耐熱達(dá)75min，rTS09-C株56℃水浴作用150min仍保持血凝活性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)rTS09-C株與TS09-C株的耐熱感染性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，rTS09-C株耐熱120min后仍具有感染性，比TS09-C株耐熱時(shí)間長(zhǎng)60min。因此，rTS0

7、9-C株不僅保留了TS09-C株耐熱的特性，而且耐熱特性得到提升。rTS09-C株這一特性對(duì)于作為疫苗載體來(lái)說(shuō)，是非常有利的條件?？墒挂呙绱蚱评滏湹氖`，廣泛地運(yùn)用于實(shí)踐中。
　　 3.表達(dá)綠色熒光蛋白重組新城疫病毒TS09-C疫苗株的構(gòu)建。
　　 在NDV TS09-C耐熱株反向遺傳操作系統(tǒng)成功建立的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)外對(duì)NDV載體改造的經(jīng)驗(yàn)，選取NP基因上游以及P和M基因的間隔區(qū)這兩個(gè)位點(diǎn)作為外源基因插入位點(diǎn)，選用便于

8、觀察、檢測(cè)的GFP基因作為外源基因;嘗試?yán)檬讉€(gè)耐熱株NDV反向遺傳平臺(tái)來(lái)拯救表達(dá)GFP基因的重組病毒。
　　 將構(gòu)建成功的全長(zhǎng)質(zhì)粒pBR-GFP-TS09-C/NP、pBR-GFP-TS09-C/M分別與3個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。收獲病毒液后，分別接種BHK-21細(xì)胞和SPF雞胚進(jìn)行增殖。通過(guò)Real-time PCR、HA試驗(yàn)，熒光顯微鏡觀察，結(jié)果表明rGFP-TS09-C/M拯救成功，而GFP插于NP上游的方案拯

9、救失敗。推測(cè)失敗原因，可能是位于NP上游的GFP的表達(dá)影響了重組病毒粒子自身的組裝合成。即得到P、M基因間隔區(qū)為較適宜的插入外源基因的位點(diǎn)。
　　 綜上所述，本論文構(gòu)建了首個(gè)NDV TS09-C耐熱株反向遺傳操作系統(tǒng)，得到了一株保留了親本株弱毒低致病力、高滴度生長(zhǎng)特性的重組新城疫病毒耐熱株。該株不僅保留了親本株耐熱的特性，并且耐熱感染性的時(shí)間延長(zhǎng)至120min。利用建立的反向遺傳操作平臺(tái)，于P和M基因的間隔區(qū)插入GFP基因，成功