結(jié)球白菜中抗寒基因的克隆及構(gòu)建香菇表達(dá)載體.pdf

1、香菇(Lentinulaedodes)是在世界范圍廣泛種植的食用菌之一，但其中的一些高溫型香菇在嚴(yán)寒的情況下的產(chǎn)量極低，香菇的這一性狀嚴(yán)重地限制了香菇在低溫下的生產(chǎn)。生產(chǎn)出抗寒性強(qiáng)和低溫高產(chǎn)的新品種香菇是其生產(chǎn)和栽培工藝中急需解決的問題，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，抗寒基因克隆和轉(zhuǎn)化的成功，為解決香菇抗寒這一難題提供了可能性。
　　抗寒基因(Cold-regulated，COR)是誘導(dǎo)合成低溫誘導(dǎo)蛋白的一種誘發(fā)基因，只有在特定條件（主

2、要是低溫和短日照）下才得以啟動和表達(dá)。因此，如果利用分子生物學(xué)方法從抗寒的結(jié)球白菜中分離出有效的抗寒基因，并通過DNA重組與轉(zhuǎn)基因技術(shù)等將這種特抗寒的基因克隆到高溫型的香菇中，從而可以使香菇品種獲得抗寒性，保證冬季高溫香菇的持續(xù)供應(yīng)。本研究克隆了COR基因，構(gòu)建了含COR基因的香菇雙元表達(dá)載體，通過根癌農(nóng)桿菌將目的基因轉(zhuǎn)移到香菇菌株內(nèi)。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)構(gòu)建了香菇表達(dá)載體，以CORR和CORF為引物，采用RT-PCR技

3、術(shù)從結(jié)球白菜的mRNA中分離得到COR基因，然后以COR基因置換了質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-nptⅡ的nptⅡ基因，構(gòu)建了適用于在食用菌中表達(dá)的COR基因表達(dá)盒PgpdA-COR-TtrpC;以質(zhì)粒pDHt/sk-hyg為模版，將克隆得到得COR基因表達(dá)盒插入到該質(zhì)粒中，構(gòu)建了潮霉素抗性的雙元載體pDHt/sk-hyg-COR。
　　(2)建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)香菇遺傳轉(zhuǎn)化體系，采用了根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化方法，以香菇菌株武香一號(W1

4、)的菌絲為受體，以pDHt/sk-hyg-COR為雙元表達(dá)載體，成功實現(xiàn)了香菇菌株W1的遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明:香菇菌株W1對潮霉素B敏感，50μg/ml能夠完全抑制它的生長;轉(zhuǎn)化效率比較低，不到7％，對轉(zhuǎn)化子的PCR和southernblot檢測表明，COR基因成功整合到香菇基因組中。遺傳穩(wěn)定性的實驗結(jié)果表明，香菇轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性好。這表明雙元載體pDHt/sk-hyg-COR可以用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，COR基因也可以用于其他食用