2015年--外文翻譯--從成人肝臟細胞取得的基因組穩(wěn)定的雙潛能干細胞的長期培養(yǎng)（譯文）

1、<p><b>　　中文7400字</b></p><p>　　出處：Huch M, Gehart H, Vanboxtel R, et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver[J]. Cell, 2015, 160(1-2):299-312.</p&g

2、t;<p>　　從成人肝臟細胞取得的基因組穩(wěn)定的雙潛能干細胞的長期培養(yǎng)</p><p>　　Meritxell Huch,1,9,10,* Helmuth Gehart,1,9 Ruben van Boxtel,1,9 Karien Hamer,1 Francis Blokzijl,1 Monique M.A. Verstegen,2</p><p>　　Ewa Ellis,

3、7 Martien van Wenum,3 Sabine A. Fuchs,4 Joep de Ligt,1 Marc van de Wetering,1,8 Nobuo Sasaki,1</p><p>　　Susanne J. Boers,4 Hans Kemperman,5 Jeroen de Jonge,2 Jan N.M. Ijzermans,2 Edward E.S. Nieuwenhuis,4<

4、;/p><p>　　Ruurdtje Hoekstra,3 Stephen Strom,6 Robert R.G. Vries,1,8 Luc J.W. van der Laan,2 Edwin Cuppen,1 and Hans Clevers1,*</p><p>　　1Hubrecht Institute-KNAW, University Medical Centre Utrecht,

5、CancerGenomics.nl, Uppsalalaan 8, 3584 CT Utrecht, the Netherlands</p><p>　　2Department of Surgery, Erasmus MC-University Medical Center, Postbus 2040, 3000 CA Rotterdam, the Netherlands</p><p>

6、　　3Surgical Laboratory, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Academic Medical Center, Meibergdreef 9, 1105 AZ Amsterdam,the Netherlands</p><p>　　4Division of Pediatric Gastroenterology, Wilhel

7、mina Children’s Hospital, University Medical Center Utrecht, Lundlaan 6, 3584 EA Utrecht,</p><p>　　the Netherlands</p><p>　　5Department of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical

8、Center Utrecht, Lundlaan 6, 3584 EA Utrecht, the Netherlands</p><p>　　6Division of Pathology, Department of Laboratory Medicine, Karolinska Institute, Alfred Nobels Alle 8, F 56 141-86 Stockholm, Sweden</

9、p><p>　　7Unit for Transplantation Surgery, Department of CLINTEC, Karolinska Institute, Karolinska University Hospital Huddinge, Ha¨ lsova¨ gen,</p><p>　　Flemingsberg, SE-141 86 Stockholm

10、, Sweden</p><p>　　8Hubrecht Organoid Technology (HUB), Uppsalalaan 8, 3584CT, Utrecht, the Netherlands 9Co-first author</p><p>　　10Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Insti

11、tute, Wellcome Trust/MRC Stem Cell Institute and Department of</p><p>　　Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, Tennis Court Road, CB2 1QN Cambridge, UK</p><p>　　*Corr

12、espondence: m.huch@gurdon.cam.ac.uk (M.H.), h.clevers@hubrecht.eu (H.C.)</p><p>　　http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.050</p><p>　　This is an open access article under the CC BY license (ht

13、tp://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　雖然人的肝臟有著巨大的復(fù)制潛能，但是現(xiàn)在仍舊沒有一個完整的系統(tǒng)可以在體外維持肝細胞的功能和復(fù)制。我們在前面已經(jīng)證實了單個小鼠的Lgr5+肝臟干細胞可以在體外擴增分化為上皮類器官，也可以在體內(nèi)和體外被擴增并分化為功能肝細胞

14、。我們現(xiàn)在描述的是能使這種從人肝臟獲得的成人膽管衍生的雙潛能祖細胞長期擴增的條件。擴增的細胞在染色體和結(jié)構(gòu)層面高度穩(wěn)定，堿基改變只有非常低的概率。這些細胞可以非常容易的在體外被轉(zhuǎn)化成功能性肝細胞，并且在體內(nèi)移植。α1-抗胰蛋白酶缺乏癥和Alagille綜合征的病人得來的類器官反映了體內(nèi)的病理。對初級成人肝臟干細胞的長期無性擴增開辟了疾病模型建立、毒理學(xué)研究、再生性藥物還有基因療法等實驗的新途徑。</p><p>

15、<b>　　簡介</b></p><p>　　肝臟主要由兩種上皮細胞組成——肝細胞和導(dǎo)管細胞。肝細胞合成必需的血清蛋白、控制代謝并為各種各樣內(nèi)源性或者外源性的分子解毒。（Duncan et al.,2009）雖然肝細胞在體內(nèi)有巨大的復(fù)制能力（Michalopoulos,2014），但是它們卻抑制體外長期培養(yǎng)。（Mitaka,1998）事實上，一個近期的研究描述了一個人肝臟細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，這個培

16、養(yǎng)持續(xù)了一周，卻只擴增了10倍。（Shan et al.,2013）作為替代品，人胚胎干細胞（hES）和人誘導(dǎo)多能干細胞（hiPS）都曾分化成肝細胞樣的細胞。然而，最近的報告結(jié)果意味著肝細胞的在引導(dǎo)和重新編排過程中發(fā)生了遺傳和表觀遺傳畸變。（Liang and Zhang,2013;Pera,2011;Lund et al.,2012）這些畸變可能是染色體突變（Laurent et al.,2011），從頭復(fù)制的基因拷貝數(shù)變異（Huss

17、ein et al.,2011）和蛋白編碼區(qū)的點突變（Gore et al.,2011）。這些改變可能會使把它們用作再生性藥物的過程變得更加復(fù)雜。</p><p>　　我們最近研發(fā)出了一種培養(yǎng)系統(tǒng)，它可以使成年小鼠單個腸（Sato et al.,2009）、胃（Barker et al.,2010）、肝臟 (Huch et al.,2013b)和胰腺（Huch et al.,2013a）干細胞長期擴增（大于一年）

18、。Lgr5是wnt配體R-spondins的受體(Carmon et al., 2011; de Lau et al., 2011)，它在這些老鼠的組織中標(biāo)記了成年干細胞(Barker et al., 2007, 2010; Huch et al.,2013a, 2013b)。這些培養(yǎng)品仍然維持它們自身原有的組織。我們最近采用了這項技術(shù)來培養(yǎng)人腸的干細胞（Jung et al.,2011;Sato et al.2011），并且證明了來自

19、患者的腸類器官概括了腸遺傳病的病理。(Bigorgne et al., 2014; Dekkers et al., 2013; Wiegerinck et al., 2014)這里，我們正在尋求建立一種人肝臟的類器官的培養(yǎng)系統(tǒng)。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　人肝臟干細胞培養(yǎng)的優(yōu)化</p><p>　　我們限定的

20、小鼠肝臟培養(yǎng)基(ERFHNic [Huch et al., 2013b])只能供人肝臟細胞存活2-3周（圖表 1A和1B和圖表S1A，頂部，可在線獲?。?。在小鼠肝臟培養(yǎng)基上的人肝臟培養(yǎng)物的基因表達樣本檢測出高活性的Tgf-β信號。像CTGF、PLAT、TIMP1和TIMP2這樣的Tgf-β靶向基因都高度表達，而Tgf-β絡(luò)合物（LTBP2和LTBP3）和Smad4抑制因子（SMURF1和SMURF2）（Massague´ et

21、 al., 2005）都未有實質(zhì)性發(fā)現(xiàn)。（圖像S1B）Tgf-β信號引發(fā)生長阻滯還有上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化（Xu et al.,2009）。小分子抑制劑A8301對Tgf-β受體Alk4/5/7的特異性抑制下調(diào)了CTGF、TIMP2、PLAT（圖表S1C），延長了培養(yǎng)的時間（~6-7周，6-7次分裂）（圖表1B），并且提高了菌落形成的效率（圖表1D）。但是培養(yǎng)物最終仍舊退化了（圖表1B和1C左側(cè)）。干細胞標(biāo)記LGR5的表達隨時間減少

22、，而像ALB或者CYP3A4這樣的分化標(biāo)記上調(diào)了（沒有給出數(shù)據(jù)）。說明我們的實驗條件在促進分化。</p><p>　　然后我們測試了其他的化合物來引發(fā)細胞的增殖和LGR5的表達（表格S1）。增殖的膽管祖細胞在穩(wěn)態(tài)的時候(Furuyama et al.,2011)和受到傷害之后(Dorrell et al., 2011; Huch et al.,2013b; Shin et al., 2011)都出現(xiàn)了。由于FSK

23、這種cAMP通路激動劑在體內(nèi)會引發(fā)膽管細胞的增殖(Francis et al., 2004)，我們不禁提出這樣的問題：cAMP會促進人肝臟細胞培養(yǎng)嗎？</p><p>　　FSK的加入會上調(diào)LGR5和導(dǎo)管標(biāo)記KRT19，而ALB和CYP3A4會減少（圖表S1D）。集落形成效率本質(zhì)上并沒有改變（圖表1D），然而培養(yǎng)物擴張后就像正在生長中的經(jīng)過數(shù)月（大于6個月）培養(yǎng)的類器官，它每周分裂比是1:4到1:6（圖表1B和1

24、C右側(cè)）。相似的情況也在其他cAMP激動劑（8-BrcAMP，霍亂毒素或者NKH477）中被觀察到（圖表S1E）。去掉Wnt激動劑R-spo或者通過porcupine抑制（IWP-2）阻塞Wnt分泌都會導(dǎo)致培養(yǎng)物的快速流失。（圖表S1F-S1H）這種效果會被外源性增加的Wnt所補救。（圖表S1H）12個額外的健康人類供體肝臟活檢在改良的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用時一致性的翻倍，達到了將近60小時，與培養(yǎng)物的年齡相互獨立。（圖表1E和1F，表格S2

25、）Edu檢測確定了這些細胞在3個月以上的時間內(nèi)還保持著他們體外增殖的狀態(tài)。培養(yǎng)物可以非常容易的被凍結(jié)和解凍。（沒有顯示數(shù)據(jù)）因此，Wnt信號，cAMP的激活和Tgf-β的抑制是長期擴增必不可少的因素。</p><p>　　來自于導(dǎo)管細胞的類器官</p><p>　　供體肝臟的膠原酶灌注使得我們能夠取得大量新鮮的、存活的并且還具有功能的人類肝細胞(Gramignoli et al., 201

26、2)（圖表S2A）我們應(yīng)用EpCAM來把肝細胞（EpCAM-）從導(dǎo)管EpCAM+導(dǎo)管細胞中差異性分離。（圖表1H,S2B,S2C）(Schmelzer et al., 2007; Yoon et al., 2011)雖然肝細胞沒有形成任何類器官，但是EpCAM+膽管細胞卻以28.4% ± 3.2%的驚人效率發(fā)展成類器官。（圖表1H,S2D,S2E）粗肝細胞制劑長成類器官結(jié)構(gòu)的效率等同于EpCAM+細胞的數(shù)量。（圖表S2F和S2

27、G）在我們的培養(yǎng)系統(tǒng)里，不是肝細胞，而是導(dǎo)管細胞形成了類器官。</p><p>　　克隆的類器官遺傳性穩(wěn)定</p><p>　　培養(yǎng)了3個月的類器官保持著正常的染色體數(shù)目（圖表3A,S4A）。從兩個供體那里我們得到了在容器里解離并培養(yǎng)了7天的活檢樣本。接下來，我們分離了單個細胞并為這兩個肝臟來源的細胞建立兩個獨立的克隆系。（培養(yǎng)物A,培養(yǎng)物B）三個月對這些培養(yǎng)物擴增之后，第二個克隆步驟執(zhí)行

28、完畢。于是我們可以判定在一個細胞的活體中、分離后和3個月培養(yǎng)中所有基因改變的累積。（圖表2A和2B）</p><p>　　我們觀察到每組培養(yǎng)物中有720-1424個堿基替代，其中63-139個堿基在3個月的培養(yǎng)里出現(xiàn)。（圖表2C）因此，大多數(shù)識別出來的堿基替換是在體內(nèi)（活著的時候）的或者在類器官形成時候出現(xiàn)的，而不是培養(yǎng)時候出現(xiàn)的。這些數(shù)字與已經(jīng)發(fā)表了的數(shù)據(jù)相比怎么樣呢？iPS細胞與他們的父代體細胞相比，包含10

29、58-1808個從頭合成的堿基替換（取決于通路步驟的第15到25步）。（Cheng et al.,2012）值得注意的是，從這些研究得來的數(shù)字不包括在體內(nèi)的父代體細胞種獲得的變異。因此，肝細胞類器官3個月的體外擴增比iPS細胞重新編排少了10倍的堿基替換。在所有的堿基替換數(shù)目中，只有一少部分是鎖定在蛋白編碼DNA上的（每組培養(yǎng)物7到9個堿基替換；圖表2D,S3）。除了一個在來自供體2的培養(yǎng)物A上的同義突變（表格S3），在早期克隆培養(yǎng)物中

30、所有的突變都存在了，說明他們不是在3個月的擴增中出現(xiàn)的。這些突變的基因沒有一個是出現(xiàn)在COSMIC數(shù)據(jù)庫里的（表格S3）。在iPS細胞里，每個鏈平均有6個堿基替換影響蛋白編碼DNA(Cheng et al., 2012; Gore et al., 2011)。</p><p>　　接下來，我們在WGS數(shù)據(jù)中尋找結(jié)構(gòu)變異。我們沒有觀察到任何染色體畸變（圖表3B）。我們在一個肝細胞類器官培養(yǎng)物中觀察到兩個基因拷貝數(shù)變

31、異（CNVs），雜交獲得。（圖表3C）哎其他的培養(yǎng)物中，我們沒有發(fā)現(xiàn)任何CNV（圖表3D和S4B-S4D）。更確切的說，這兩個CNVs在早期培養(yǎng)物中就已經(jīng)存在了，因此它們不是在長期培養(yǎng)中獲得的。ES細胞培養(yǎng)物都會表現(xiàn)出變異的染色體組型(Baker et al., 2007)，并且iPS細胞能容納相當(dāng)大數(shù)目的體細胞基因拷貝數(shù)變異(Hussein et al., 2011; Laurent et al., 2011; Martins-Tay

32、lor et al., 2011; Mayshar et al., 2010;Abyzov et al., 2012)。</p><p>　　在體外和移植后分化成功能性肝細胞</p><p>　　干細胞標(biāo)記PROM1和LGR5，還有導(dǎo)管標(biāo)記（SOX9，OC2）和肝細胞標(biāo)記（HNF4a）都非常容易的表達。（圖表4A，S5A,S5B）從組織學(xué)上講，肝細胞類器官展示出像導(dǎo)管樣的顯型，可以表現(xiàn)為（

33、1）單層上皮細胞，表達出細胞角質(zhì)蛋白標(biāo)記KRT19和KRT7，或者（2）有無極性的E-Cadherin+HNF4a+和一些KRT7+細胞的假復(fù)層上皮細胞（圖表4B-4D）。SOX（圖表4E）和EPHB2（圖表4F）幾乎在所有細胞中都可以被檢測到，而LGR5只能在EPHB2+的群落里檢測到（圖表4F）。類器官不能表達像Albumin或者CYP3A4這樣的成熟肝細胞的標(biāo)記（圖表4A和5C，EM條）。因此，我們確定了人細胞分化培養(yǎng)基（DM）（

34、表格S1）。去掉生長刺激物R-spo和FSK會導(dǎo)致Albumin和CYP3A4的上調(diào)（圖表S5C）。之后我們往這個培養(yǎng)基里加入了Notch抑制劑DAPT(Huch et al., 2013b)，F(xiàn)GF19(Wu et al., 2011),還有dexamethasone(Rashid et al., 2010) (Figure S5D)。BMP7 據(jù)報道會加速肝</p><p>　　為了測試類器官在體內(nèi)作為肝細胞

35、移植的能力，我們?yōu)橛蠧CL4retrorsine的Balb/c裸鼠手術(shù)引入急性肝損傷。這個手術(shù)需要肝移植。(Guo et al., 2002; Schmelzer et al.,2007)使用人特異性抗體（圖表S6A），我們最初在移植后2小時和2天的時候檢測到KRT19陽性的導(dǎo)管樣的細胞，分布在整個肝實質(zhì)。（圖表S6B）在隨后的時間點上，我們觀察到ALB+，KRT19-人類細胞，單個或者成對的，或者更少的，成更大的肝細胞病灶（圖表6H,

36、S6C）。需要注意的是，我們的損傷模型在移植后對移植的擴張沒有任何刺激。人白蛋白和α-1-antitrypsin都在7-14天內(nèi)受體小鼠的血清中以高水平被發(fā)現(xiàn)，并且在60多天里的六分之五的小鼠和在120多天里五分之二的動物中維持穩(wěn)定。（圖表6I，S6D,S6E）雖然人主肝細胞移植最初產(chǎn)生的人白蛋白含量非常高，（圖表6I）但是在一個月內(nèi)含量就趨近于移植的類器官。</p><p>　　病人類器官模型發(fā)病機制</

37、p><p>　　α-1-antitrypsin（A1AT）缺乏癥是一種遺傳病，它使得患者更容易得慢性阻塞性肺病和慢性肝病(Stoller and Aboussouan, 2005)。A1AT是從肝臟分泌出來用來從中性粒細胞彈性蛋白酶那保護肺免受蛋白水解損傷。最經(jīng)常的突變是Z allele (Glu342Lys) of the SERPINA1 gene，它會引發(fā)肝細胞內(nèi)A1AT的錯誤折疊的積累。ZZ突變的表型是血漿中

38、蛋白質(zhì)減少80%，這隨后會造成肺氣腫(Stoller and Aboussouan, 2005)。三個被診斷為A1AT缺乏的病人的活檢（表格S2，圖表S7A）受到組織學(xué)的刻畫，RNA和DNA的分離還有培養(yǎng)的擴增。在培養(yǎng)基里，類器官都生長超過4個月，并且表現(xiàn)正常?；虮磉_分析顯示出在DM里細胞分化正常。（圖表S7B）功能性測試顯示，已經(jīng)分化了的從A1AT病人得來的細胞分泌高含量的白蛋白，并且像健康的供體來源的類器官培養(yǎng)物一樣占據(jù)LDL（圖

39、表7B-7D）。在A1AT缺乏中，肝病的分子學(xué)發(fā)病機理與肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)里蛋白質(zhì)聚集相關(guān)。(Lawless et al., 2008)A1AT蛋白聚集在分化的類</p><p>　　使用Alagille綜合征（AGS）病人的活檢，我們測試了膽道樹的結(jié)構(gòu)缺陷是否也可以用來建模。AGS是缺口信號通路突變導(dǎo)致的，它會導(dǎo)致部分或者全部膽道閉鎖。(Kamath et al., 2013)病人的類器官在未分化狀態(tài)是與他們健康的器

40、官是同步的。 然而，在分化成單細胞的時候去掉R-spondin，Nicotinamide, TGFbi, 和FSK，AGS病人類器官不能上調(diào)單細胞標(biāo)記，諸如KRT19和KRT7（圖表S7E）。對KRT19的染色顯示膽管細胞非常稀少，并且不能整合到上皮細胞中。相反，它們聚成一團，然后在類器官腔中凋亡。（圖表S7F）。在AGS老鼠模型中，JAGGED-1/NOTCH2在膽道譜系規(guī)范中是非必需的，但是在膽道形成過程中是必須的。(Geisler

41、 et al., 2008; McCright et al.,</p><p>　　2002)因此，AGS肝類器官構(gòu)成了研究Alagille綜合征的第一個3D人類模型系統(tǒng)。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　肝疾?。◤幕蜻z傳疾病到病毒性肝炎、肝癌還有和肥胖相關(guān)的脂肪肝）在美國主要死因中排名第十二。(Heron, 2

42、012)不能解決肝病這個問題還要歸咎于供體肝的缺乏(Vilarinho and</p><p>　　Lifton, 2012)，還有我們對于肝病理機制理解的不全面。作為疾病模型或者作為細胞移植治療來源而培養(yǎng)的任何細胞，評判它們的價值依靠的是它們擴增潛能的保真度和穩(wěn)健性，也依靠它們保持正?；蚝捅碛^遺傳狀態(tài)的能力。(Pera, 2011).hESC分化的可能性還有成纖維細胞（iPS）重新編程為從神經(jīng)細胞到肝細胞的任

43、何分化的細胞類型，使得包括A1AT-D在內(nèi)的許多人類基因疾病的建模成為可能。(Rashid et al., 2010)然而，培養(yǎng)的干細胞遺傳的不穩(wěn)定性引起了人們對于它們是否能在細胞移植治療中安全使用的擔(dān)憂。(Bayart and Cohen-Haguenauer, 2013).</p><p>　　這里，我們展示的是初代人膽管細胞可以非常容易的在體外擴增為雙潛能干細胞從而形成3D的類器官。這些細胞在體外分化成功能

44、性肝臟細胞并且生產(chǎn)移植后的真正的肝臟細胞。體外培養(yǎng)的類器官的遺傳穩(wěn)定性的廣泛分析表明，在培養(yǎng)的數(shù)個月里，擴增的細胞保持他們遺傳完整性。這些結(jié)果與我們先前對老鼠的觀察相吻合(Huch et al.,2013b)，但卻與最近出版物中所描述的那種利用多譜系追蹤的方法，導(dǎo)管干細胞不能促進老鼠肝細胞重生的說法形成了鮮明的對比。(Schaub et al., 2014; Yanger et al., 2014; Yanger et al., 201

45、3)。我們的結(jié)果就像是斑馬魚和大鼠模型展示的內(nèi)容一樣：在肝細胞近乎完全缺失或者增生被阻斷的情況下，膽管上皮細胞轉(zhuǎn)化成了肝細胞。(Choi et al., 2014) (Michalopoulos, 2014)我們的數(shù)據(jù)在人類爆發(fā)性肝衰竭中被進一步證實。在這種爆發(fā)性肝衰竭中有80%以上的肝細胞缺失，可以觀察到大量增生的EpCAM+膽上皮細胞。(Hattoum et al., 2013)</p><p>　　從A1A

46、T-缺乏的患者得來的類器官可以在體外擴增并且模仿體內(nèi)的病理。相似的，從Alagille綜合征患者得來的類器官會重新產(chǎn)生在現(xiàn)在這些患者膽道有的那種的結(jié)構(gòu)性缺陷。用CRISPR/Cas9同源重組的技術(shù)進行修復(fù)在類器官培養(yǎng)中是可行的，就像我們最近對囊性纖維化患者的結(jié)腸干細胞的展示一樣。(Schwank et al.,2013)許多單基因遺傳病都會影響肝臟，而這些遺傳病都應(yīng)該是服從體外對克隆的肝臟祖細胞進行基因修復(fù)途徑?？傊?，我們的結(jié)果使人們可

47、以開始使用在體外擴增的人肝臟材料來實驗。這種材料是替代供體肝細胞的新的用來研究肝臟重生，肝臟疾病機制，細胞移植療法，毒理學(xué)研究或者毒物測試的肝細胞來源。</p><p><b>　　實驗步驟</b></p><p><b>　　人肝臟類器官培養(yǎng)</b></p><p>　　從供體那里得到肝臟活檢(0.5–1 cm3)，肝臟

48、外植體是從在Erasmus MC, Rotterdam做的肝臟移植中得到的。Erasmus醫(yī)療中心的醫(yī)學(xué)倫理學(xué)會批準(zhǔn)了這個材料的研究性使用。我們也已經(jīng)獲得所有病人的知情同意。對于EPCAM分類實驗和肝細胞的分離，初代人肝組織的獲取是經(jīng)過知情同意的，也得到了區(qū)域倫理委員會Karolinska機構(gòu)的CLINTEC分部的允許(Dnr: 2010/678-31/3) (Jorns et al., 2014).。用accutase膠原蛋白酶消化肝

49、細胞，將它從人肝臟活檢（0.5-1cm3）中分離出來，就像擴展實驗步驟描述的那樣。不同的部分是混合到一起的，我們用冷的高級DMEM/F12清洗并在300-400轉(zhuǎn)速下離心5分鐘。將細胞團與基質(zhì)膠（BD Biosciences）或者簡化的生長因子BME2（2型基底膜提取物，Pathclear）混合，3000-10000個細胞接種到48孔板的一個孔里。這用的是無連接的板（Greiner）。在基質(zhì)膠或者BME凝固之后，加入培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是基于

50、AdDMEM/F12 (Invitrogen)，補充了1%的N2，1%</p><p>　　生長曲線和擴增比在擴充實驗步驟中被具體展示和計算。</p><p>　　分離EpCAM+ Cells 和Single-Cell Culture</p><p>　　細胞懸浮液的制備同擴展實驗步驟，將它用抗人CD326（EpCAM）染色，在Moflo分選機(Dako Cytom

51、ation)中分類，之后的4天里，像上面描述的那樣補充Y-27632 (10 mM, Sigma Aldrich)到培養(yǎng)基后培養(yǎng)。傳代是在分裂比為1:4-1:8，每星期一次。</p><p>　　對于細胞增殖實驗，單細胞懸液用FSC和脈沖寬度來分類，區(qū)分單個細胞。用碘化丙啶染色來標(biāo)記死亡細胞還有FSC：脈沖庫寬度門控來排除雙峰細胞(MoFlow, Dako)分出來的細胞被種到基質(zhì)膠和96孔板上，每孔一個細胞。細胞

52、培養(yǎng)如上所述。</p><p>　　肝細胞分化和體外功能性研究</p><p>　　肝類器官被種下，并在上面所說的肝臟培養(yǎng)基（EM，擴增培養(yǎng)基）中，并且補充了BMP7 (25 ng/ml之后，保存7-10天。然后培養(yǎng)物被分離、接種到相應(yīng)的補充有BMP7的EM中，存放至少2-4天。然后，培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基（DM）：AdDMEM/F12 培養(yǎng)基補充有 1%的 N2</p>&l

53、t;p>　　和 1%的 B27，含有 EGF (50 ng/ml),胃泌素 (10 nM, Sigma), HGF(25 ng/ml), FGF19 (100 ng/ml), A8301 (500 nM), DAPT (10 uM), BMP7(25 ng/ml),還有dexamethasone (30 uM)。分化培養(yǎng)基每11-13天換2-3次。</p><p>　　為了評估肝細胞的功能，培養(yǎng)基在上一次更

54、換的24小時后會被采集。功能性研究從采集的上清液或者整個類器官中完成，就像擴展實驗步驟中描述的那樣。</p><p><b>　　移植</b></p><p>　　我們用了一個Guo等人的修改版的實驗報告(Guo et al.,2002)。簡單來說，我們對缺乏BALB/c的雌性裸鼠注射了兩針70 mg/kg Retrorsine (Sigma)，分別是在移植前30和1

55、4天。移植前一天，老鼠通過IP注射得到了0.5 ml/kg CCl4 還有50 mg/animal anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries)。另外，動物還接受7.5 ug/ml FK506在飲用水中，直到實驗結(jié)束肝重生報告成陽性。(He et al., 2010)移植當(dāng)天，老鼠被麻醉，從4個獨立供體（p6-p10）或者新分離的肝細胞（兩個供體）得來的1–2 3 106 個人肝臟類器官

56、細胞懸液被注射到脾臟內(nèi)。移植的小鼠每周都要注射50 mg/animal anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries)來消耗NK細胞。為了監(jiān)測移植狀態(tài)，我們規(guī)律的從尾部靜脈抽取血樣并用每個人特異性的ELISA (Assaypro)分析當(dāng)前人白蛋白和人a1-antitrypsin。</p><p>　　核型分析和遺傳穩(wěn)定性分析</p><p>

57、　　成指數(shù)形式增長的類器官培養(yǎng)物在16小時內(nèi)都被輔以0.05 ug/ml秋水仙堿(GIBCO)。然后，培養(yǎng)物被TrypLE express (GIBCO)分成單個細胞，并進行標(biāo)準(zhǔn)的核型分析。</p><p>　　用來進行WGS分析的DNA文庫是用標(biāo)準(zhǔn)方法從1ug的遺傳DNA中產(chǎn)生的(Illumina)。作為參考樣本，不同供體的肝活檢被排成統(tǒng)一的深度。序列讀數(shù)、基因拷貝數(shù)變異的調(diào)用還有堿基替換的分析都在擴展實驗步驟

58、中被具體描述。整個的基因序列的數(shù)據(jù)被存放在EMBL歐洲核苷酸檔案中，編號ERP005929。</p><p>　　免疫組織化學(xué)，免疫熒光和圖像分析</p><p>　　組織和類器官被分別固定在甲醛或者4%的PFA中，并像擴展實驗步驟中描述的那樣染色、成像。</p><p>　　A1AT-D功能實驗</p><p>　　彈性纖維酶抑制法還有磷酸

59、化的elF8α的檢測都如擴展實驗步驟中所寫。</p><p><b>　　微陣列</b></p><p>　　為了分析人肝培養(yǎng)物的表達，整個RNA都被從肝臟活檢或者我們規(guī)定的培養(yǎng)基中生長的類器官培養(yǎng)物中分離出來，按廠商說明使用QIAGEN RNA酶試劑盒。500ng的RNA被標(biāo)記出來，只有少部分RNA被輸入線性放大盒(Agilent Technologies)。通用的

60、人rRNA (Agilent)被差異的標(biāo)記，并與組織或者培養(yǎng)樣本雜交。使用4X 44 K Agilent整個人類基因基因組雙色微陣列(G4122F)。標(biāo)記、雜交和沖洗都是按照Agilent指南操作的。微陣列信號還有背景信息都用Feature Extraction software (V.9.5.3, Agilent Technologies)取得。分層聚群分析在整個肝組織或者類器官實驗中被使用。在分層聚群分析中還用到了一個3倍體的切片。

61、</p><p><b>　　數(shù)據(jù)分析</b></p><p>　　所有值都表示為平均的掃描電鏡。我們還使用了人Whitney非參數(shù)檢驗。在所有情況下，使用的數(shù)據(jù)是從至少三個獨立的實驗中得來的。所有的計算采用SPSS軟件包進行。</p><p><b>　　序列號</b></p><p>　　克隆類

62、器官培養(yǎng)物的全部基因序列數(shù)據(jù)已經(jīng)被儲存到EMBL歐洲核苷酸檔案中，序列號ERP005929。本實驗的基因表達數(shù)據(jù)被存到GEO知識庫，序列號GSE63859。</p><p><b>　　補充信息</b></p><p>　　補充信息包括擴展實驗步驟，7個圖表還有5個表格。本文獻可以從以下地址找到：http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.201

63、4.11.050</p><p>　　AUTHOR CONTRIBUTIONS（省略）</p><p>　　REFERENCES（省略）</p><p>　　圖表1從導(dǎo)管細胞得來的生長的肝類器官</p><p>　　3000或10000人初代肝臟細胞被種到48孔板的每個孔里，像說明的那樣使用不同的培養(yǎng)條件。</p><p&

64、gt;<b>　　實驗計劃方案</b></p><p>　　老鼠肝臟培養(yǎng)皿(ERFHNic)或者補充了A8301(A)或者 A8301和Forskolin(FSK)的培養(yǎng)皿。培養(yǎng)物每隔7-10天分離，在1:4-1:8稀釋。補充A8301和FSK會顯著增加擴增效率。生長大于18代，分裂比是1:4-1:6每7-10天，持續(xù)大于5個月。實驗三份，每條都表示不同的供體。</p><

65、;p>　　老鼠肝臟培養(yǎng)基中有A8301和有（左）或者沒有（右邊）FSK類器官的DIC圖像，放大率4X</p><p>　　群落形成效率百分比：在有或者沒有A8301和/或FSK。實驗三份，來自五個供體。結(jié)果被呈現(xiàn)成五個獨立實驗的平均掃描電鏡。</p><p>　?。‥-G）擴增率，體外生長曲線，EdU摻入量在EM里培養(yǎng)的在早期和末期的代的細胞被分析。E和F圖片說明了每代細胞每個孔里數(shù)

66、到的細胞數(shù)：從P1-P4(E),P16-P18(F)。結(jié)果被表示成三個獨立培養(yǎng)物的平均掃描電鏡。數(shù)目翻倍的時間被計算出來，就像擴展實驗步驟描述的那樣。（G）EdU摻入量仍舊在末代中被檢測出來。</p><p>　?。℉）人肝臟細胞懸液被分開到EpCAM+導(dǎo)管細胞和更大的EpCAM-肝細胞中（如需要確切的選擇策略，參見圖表S2C）。群體的鑒定結(jié)果被白蛋白和KRT19染色確認。分出來的細胞培養(yǎng)了14天。類器官是專門從

67、EpCAM+導(dǎo)管細胞中獲得的。</p><p>　　同樣參見圖表S1，S2。</p><p>　　圖表2人類器官在培養(yǎng)中保持遺傳學(xué)穩(wěn)定性</p><p>　　克隆的培養(yǎng)物是在每個孔中種一個分出來的細胞得到的。DIC圖像放大倍率是：40X (0–10天), 4X (20天之前).</p><p>　　實驗裝置示意圖。2個獨立的供體的肝臟活檢被培

68、養(yǎng)1周。單個細胞生長成群。得到了兩個獨立的類器官培養(yǎng)物。在長期的擴增之后，第二步克隆擴增開始實施。作為結(jié)果的類器官培養(yǎng)物接受了WGS分析。為了獲得所有的體細胞變異，變異體在原始的活檢中被過濾。為了決定長期培養(yǎng)對遺傳穩(wěn)定性的影響，體細胞變異被從早期代數(shù)的培養(yǎng)物中過濾出去。</p><p>　　扇形圖說明了每個供體被調(diào)查的基因的百分比。右邊面板顯示的是觀察到的堿基替換的總數(shù)。說明的是每個培養(yǎng)物體細胞堿基替換的總數(shù)，還

69、有被長期誘導(dǎo)培養(yǎng)的數(shù)目。</p><p>　　左面板說明的是體細胞堿基替換的總數(shù)，右面板說明的是影響蛋白編碼DNA的因素。參見圖表S3。</p><p>　　圖表3人肝臟類器官的結(jié)構(gòu)性變異</p><p>　　代表性的染色體圖像：類器官培養(yǎng)了16天（P1）和90天（P14）。是正常的染色體數(shù)（n=46）。在任何分析的樣本里（n=15）沒有主要染色體的異常。具體的染色

70、體數(shù)目在圖表S4中展示。</p><p>　　從活檢中（上）和從供體2得來的培養(yǎng)物A中（下）不同的染色體中獲得的整個基因組序列數(shù)據(jù)的讀全分析。</p><p>　　在培養(yǎng)物A中，對于3號染色體一個區(qū)域的拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)了雜合子增益。</p><p>　　對兩個供體不同類器官培養(yǎng)物的拷貝數(shù)分析的總結(jié)。從供體2獲得的在培養(yǎng)物A的體細胞拷貝數(shù)變異被專門觀察到，并且已經(jīng)存在于

71、父代培養(yǎng)物。</p><p><b>　　參見圖表S4。</b></p><p>　　圖表4人肝臟類器官標(biāo)記的表達</p><p>　?。ˋ和B）用RT-PCR（A）和免疫熒光（B）在EM中生長的人肝臟培養(yǎng)物中分析基因表達。</p><p>　　基因表達在早期和晚期被分析。人肝臟培養(yǎng)物表達出祖細胞(LGR5, SOX9)

72、，導(dǎo)管細胞(KRT19, SOX9)和肝臟細胞(HNF4A)的標(biāo)記，但是沒有白蛋白標(biāo)記（ALB）。結(jié)果指示成2-dCt (2DDCT)。代表從5個獨立供體培養(yǎng)物得來的3個獨立實驗平均掃描電鏡的值。2DDCT被計算出使用持家基因GAPDH作為編碼基因。組織，整個肝臟溶解產(chǎn)物。</p><p>　　(B-F)共聚焦圖像染色ECAD和肝細胞標(biāo)志HNF4（B）和導(dǎo)管標(biāo)記（KRT19 [C]，[D]和Sox9 KRT7，[

73、E ]）。原子核Hoechst染色。（F）共聚焦圖像染色EPCAM（藍色）。干細胞標(biāo)記Lgr5（綠色）被限制在Wnt靶基因EphB2（紅色）的細胞染色的一個子集里。刻度條，50 um (B–E 還有 F, 左); 25 um (F, 右)。</p><p><b>　　參見圖表S5。</b></p><p>　　圖表5類器官分化成肝細胞</p><

74、p>　　人肝臟培養(yǎng)物擴增一個月以上然后被轉(zhuǎn)移到DM里。</p><p><b>　　實驗策略</b></p><p>　?。˙和C）肝細胞基因的表達決定于熒光標(biāo)記（B）或者qPCR (C) 在11天之后。（B）白蛋白的熒光標(biāo)記(ALB,紅色)還有ZO-1(綠色)?？潭葪l：25um左；30um右。(C)對于白蛋白和細胞色素p450 3A4的qPCR分析。圖像說明的

75、是三個獨立的實驗的平均電鏡掃描。組織：肝臟的整個裂解液。**EM與DM p<0.01</p><p>　　EM里生長的或者DM里培養(yǎng)11天的人肝細胞培養(yǎng)物的整個基因組的轉(zhuǎn)錄組分析。熱圖顯示基因簇高度表達在肝組織和分化的類器官里。值得注意的是，這個基因簇包含了必須的基因，如同說明的那樣，是紅色的。綠色，下調(diào)的；紅色，上調(diào)的。</p><p><b>　　參見圖表S5。<

76、/b></p><p>　　圖表6肝臟培養(yǎng)物在體內(nèi)和體外顯示出肝細胞功能</p><p>　　在EM或者DM中生長11天的類器官的糖原累積是通過PAS（Periodic-Acid Schiff）染色的。PAS染色（粉色）被專一的觀察到，在分化后（DM），說明累積糖原的能力。放大倍率：10X</p><p>　　LDL占用是用Dil-ac-LDL熒光底物（紅色）

77、分析的，在EM(左)或者DM（右）中培養(yǎng)11天之后。只有DM中保留的培養(yǎng)物結(jié)合了底物（紅色）。細胞核被DRAQ5復(fù)染?？潭葪l，25um。</p><p>　　在24小時里白蛋白產(chǎn)物是在上清液中測量的。結(jié)果用平均掃描電鏡表示。</p><p>　　CYP3A4活性是用DM里培養(yǎng)11天的培養(yǎng)物測量的。結(jié)果表現(xiàn)為RLU/ml/百萬個細胞。HEK293T細胞和HepG2細胞被分別用作正向和逆向控制

78、。值得注意的是在DM上的DM類器官顯示CYP3A4的活性，就像新鮮分離出來的肝細胞。（圖表S2A）每種條件三份實驗都被分析。結(jié)果展示為4個獨立供體分離出來的培養(yǎng)物所做的2個獨立的實驗的平均電鏡掃描。</p><p>　　Midazolam代謝由于功能性CYP3A3/4/5酶被專一性實現(xiàn)。從兩個不同的供體得來的三個不同的類器官培養(yǎng)物和HepG2細胞都如同描述被培養(yǎng)了11天。Midazolam被加入培養(yǎng)基（5uM），

79、24小時后確定了1-OH咪達唑侖和1-OH咪達唑侖葡糖苷酸的濃度。每個條件和供體的副本都被分析。結(jié)果表示為兩個獨立實驗的平均電鏡掃描。</p><p>　　用兩個獨立供體分離出來的培養(yǎng)物做的兩個獨立實驗的膽汁酸產(chǎn)物用掃描電鏡展示。每個條件和供體的副本都被分析。</p><p>　　氨消除，用n=3的用兩個獨立供體分離出來的培養(yǎng)物做的獨立實驗的掃描電鏡展示。用nM/h/百萬個細胞給出。<

80、;/p><p>　　Retrorsine/CCl4處理的Balbc/裸鼠被一直了1-2X106個人的肝臟類器官細胞，在120天后死亡。人Albumin+/ KRT19-的肝細胞的病灶的存在表明在小鼠肝臟的移植和分化。</p><p>　　移植后人血清白蛋白水平。結(jié)果用兩方面控制的動物，兩個主要肝細胞移植的老鼠還有六個人類肝臟類器官移植的動物的掃描電鏡展示。</p><p&g

81、t;　　**p < 0.01 *p < 0.05 比較EM與DM時。參見圖表S5和S6。</p><p>　　圖表7人A1AT缺乏肝臟培養(yǎng)物作為體內(nèi)疾病模型</p><p>　　A1AT缺乏的患者分離的肝臟類器官在第二代和第11代（4X放大）</p><p>　　白蛋白從供體分泌到上清液中，A1AT缺乏患者類器官在EM或者在DM里11天后。結(jié)果被表述為兩

82、個獨立實驗的平均電鏡掃描。</p><p>　　A1AT缺乏類器官分化了11天，并且用DiI-Ac-LDL培育。熒光顯微鏡顯示出強大的LDL占用在病人的類器官里?？潭葪l：50um</p><p>　　在供體和A1AT患者類器官分化11天后的白蛋白和CYP3A4 mRNA水平的代中誘導(dǎo)。結(jié)果用平均電鏡掃描表示。</p><p>　?。‥-H）肝組織（E和G）上的、健康

83、供體肝細胞分離的類器官（F）上的還有典型A1AT缺乏患者的A1AT的免疫組織化學(xué)。</p><p>　　（H）箭頭指出A1AT蛋白在病人分離的肝組織（G）和類器官（H）處聚集?？潭葪l，20um。</p><p>　　（I）A1AT從分化后11天的供體和病人的類器官分泌到上清液的ELISA測量。結(jié)果被表達為兩個獨立實驗的平均掃描電鏡。</p><p>　?。↗）分化的