豬圓環(huán)病毒2型GEM顆粒疫苗的初步研究.pdf

1、PCV2是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原之一，造成宿主生長緩慢，免疫機能下降，易與豬皮炎腎病綜合癥(PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)疾病、豬支原體肺炎等一種或多種疾病共發(fā)，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失。國產PCV2傳統(tǒng)滅活疫苗免疫效果不十分理想，主要原因是細胞增殖病毒滴度低和免疫抑制。因此，研制安全、高效、廉價的PCV2亞單位疫苗，替代進口同類產品，具有重要的現(xiàn)實意義。
　　GEM（Gram positive enhanc

2、er matrix）顆粒表面展示系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的新技術，國外已有應用該技術研制新型人用疫苗的多篇報道。GEM是將乳酸菌經熱酸處理、去除細菌原有蛋白質和核酸等大分子物質后獲得的細胞壁肽聚糖骨架，具有特異性非共價結合細菌細胞壁水解酶C端結構域(Protein Anchor，PA)的特性。因此，與PA融合表達的目標抗原，可以高密度地展示在GEM顆粒表面。該系統(tǒng)用于研發(fā)新疫苗的獨特優(yōu)勢包括:一是后期抗原純化僅需低速離心即可，疫苗制備快速、價

3、廉;二是GEM顆粒的主要成分肽聚糖本身具有免疫增強功能，可提高疫苗免疫效力;三是GEM顆粒源自食品級乳酸菌，與目標抗原結合、離心純化后無核酸殘留，因此無生物安全風險。
　　本文應用GEM顆粒表面展示系統(tǒng)，成功研制出表面展示PCV2-Cap蛋白的GEM顆粒疫苗，并對其免疫原性進行了初步評價。實驗表明，PCV2-Cap-PA融合蛋白產量高，GEM顆?？乖庖咴院茫瑸檠兄芇CV2新型亞單位疫苗打下堅實的基礎。
　　1.GEM-P

4、A系統(tǒng)基礎構件的制備與鑒定
　　GEM顆粒制備與鑒定。離心收集GM17培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)的乳酸乳球菌（MG1363株），菌體洗滌后用0.1mol/L的HC1重懸，煮沸30min，洗滌后計數(shù)。規(guī)定2.5×109 GEM顆粒為1U，將其濃度調整為10 U/ml，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｍ干潆娮语@微鏡觀察表明，GEM顆粒保持細菌原有骨架外形和大小，表面較為平滑，內部呈現(xiàn)均一的灰色，證明細菌原有蛋白質和核酸等大分子物質均已完全去除。
　　錨鉤

5、蛋白PA制備與鑒定。以乳酸乳球菌（MG1363株）基因組RNA為模板，利用RT-PCR方法，分別獲得含有2、3個LySMs基序的基因片段，連入表達載體pET-32a(+)中，原核誘導表達，獲得37 kDa和29.4 kDa兩個蛋白質，均為包涵體形式表達，分別命名為PA2和PA3。
　　GEM與PA特異性結合鑒定。1 U GEM顆粒離心，分別用500μg復性后PA2和PA3蛋白重懸，室溫孵育30 min，離心收集沉淀。SDS-PAG

6、E鑒定其結合效果。結果表明，PA2和PA3蛋白均能與GEM結合，但PA3與GEM顆粒結合活性明顯要優(yōu)于PA2。透射電子顯微鏡觀察表明，GEM顆粒結合PA蛋白后，在其表面形成一層十分明顯的絮狀物。
　　2.PCV2-Cap蛋白顆?？乖苽渑c鑒定
　　融合蛋白的制備與鑒定。以PCV2（NJ株）DNA為模板，獲得ORF2基因。分別構建PA與PCV2-Cap N端和C端相連的兩種融合基因的重組質粒pQZ-PA3-Cap和pQZ-Ca

7、p-PA3，利用大腸桿菌可溶性表達平臺CVC1102對融合基因進行表達。SDS-PAGE鑒定表明，獲得融合蛋白為44.6 KD，Cap-PA3表達量要遠低于PA3-Cap的表達量。其中，PA3-Cap約60-70％為可溶性表達。Western-blotting分析顯示，兩種融合蛋白與豬PCV2特異性抗血清呈陽性反應。
　　融合蛋白與GEM顆粒結合特性鑒定。取1U GEM顆粒各與2 ml Cap-PA3、PA3-Cap蛋白室溫下結合

8、，分別進行SDS-PAGE、電子顯微鏡觀察及間接免疫熒光試驗鑒定。結果表明，兩種重組蛋白均可與GEM顆粒特異性結合，結合后的GEM顆粒表面形成一層較厚的PA-Cap蛋白層，該層蛋白可與PCV2特異性熒光抗體結合。此外，本章研究還建立了GEM-PA-Cap完全解離的SDS加熱方法，用于PA3-Cap抗原定量分析。
　　3.PCV2-Cap顆?？乖庖咴猿醪窖芯?br>　　制備PA3-Cap融合蛋白，與GEM顆粒結合后，獲得PCV2

9、-GEM顆?？乖琍A3-Cap含量為1 mg/mL。按照100μg/頭的劑量，PCV2-GEM顆?？乖謩e不同的佐劑混合乳化，獲得試驗性疫苗，4℃保存?zhèn)溆谩＿x擇2-3周齡、抗原和抗體雙陰性仔豬54只，將其分為6個實驗組和2個對照組。頸部肌肉注射免疫，免疫3周后采血，用間接ELISA試劑盒檢測抗體。結果表明， Y佐劑與L佐劑、鋁膠佐劑和206佐劑相比，與GEM-PA3-Cap抗原配合免疫產生的抗體水平最高。在Y佐劑中添加免疫增強劑CVC