豬圓環(huán)病毒2型GEM顆粒疫苗的初步研究.pdf

1、PCV2是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原之一，造成宿主生長緩慢，免疫機能下降，易與豬皮炎腎病綜合癥(PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)疾病、豬支原體肺炎等一種或多種疾病共發(fā)，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。國產(chǎn)PCV2傳統(tǒng)滅活疫苗免疫效果不十分理想，主要原因是細(xì)胞增殖病毒滴度低和免疫抑制。因此，研制安全、高效、廉價的PCV2亞單位疫苗，替代進口同類產(chǎn)品，具有重要的現(xiàn)實意義。
　　GEM（Gram positive enhanc

2、er matrix）顆粒表面展示系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，國外已有應(yīng)用該技術(shù)研制新型人用疫苗的多篇報道。GEM是將乳酸菌經(jīng)熱酸處理、去除細(xì)菌原有蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)后獲得的細(xì)胞壁肽聚糖骨架，具有特異性非共價結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶C端結(jié)構(gòu)域(Protein Anchor，PA)的特性。因此，與PA融合表達(dá)的目標(biāo)抗原，可以高密度地展示在GEM顆粒表面。該系統(tǒng)用于研發(fā)新疫苗的獨特優(yōu)勢包括:一是后期抗原純化僅需低速離心即可，疫苗制備快速、價

3、廉;二是GEM顆粒的主要成分肽聚糖本身具有免疫增強功能，可提高疫苗免疫效力;三是GEM顆粒源自食品級乳酸菌，與目標(biāo)抗原結(jié)合、離心純化后無核酸殘留，因此無生物安全風(fēng)險。
　　本文應(yīng)用GEM顆粒表面展示系統(tǒng)，成功研制出表面展示PCV2-Cap蛋白的GEM顆粒疫苗，并對其免疫原性進行了初步評價。實驗表明，PCV2-Cap-PA融合蛋白產(chǎn)量高，GEM顆?？乖庖咴院?，為研制PCV2新型亞單位疫苗打下堅實的基礎(chǔ)。
　　1.GEM-P

4、A系統(tǒng)基礎(chǔ)構(gòu)件的制備與鑒定
　　GEM顆粒制備與鑒定。離心收集GM17培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)的乳酸乳球菌（MG1363株），菌體洗滌后用0.1mol/L的HC1重懸，煮沸30min，洗滌后計數(shù)。規(guī)定2.5×109 GEM顆粒為1U，將其濃度調(diào)整為10 U/ml，-80℃保存?zhèn)溆?。透射電子顯微鏡觀察表明，GEM顆粒保持細(xì)菌原有骨架外形和大小，表面較為平滑，內(nèi)部呈現(xiàn)均一的灰色，證明細(xì)菌原有蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)均已完全去除。
　　錨鉤

5、蛋白PA制備與鑒定。以乳酸乳球菌（MG1363株）基因組RNA為模板，利用RT-PCR方法，分別獲得含有2、3個LySMs基序的基因片段，連入表達(dá)載體pET-32a(+)中，原核誘導(dǎo)表達(dá)，獲得37 kDa和29.4 kDa兩個蛋白質(zhì)，均為包涵體形式表達(dá)，分別命名為PA2和PA3。
　　GEM與PA特異性結(jié)合鑒定。1 U GEM顆粒離心，分別用500μg復(fù)性后PA2和PA3蛋白重懸，室溫孵育30 min，離心收集沉淀。SDS-PAG

6、E鑒定其結(jié)合效果。結(jié)果表明，PA2和PA3蛋白均能與GEM結(jié)合，但PA3與GEM顆粒結(jié)合活性明顯要優(yōu)于PA2。透射電子顯微鏡觀察表明，GEM顆粒結(jié)合PA蛋白后，在其表面形成一層十分明顯的絮狀物。
　　2.PCV2-Cap蛋白顆?？乖苽渑c鑒定
　　融合蛋白的制備與鑒定。以PCV2（NJ株）DNA為模板，獲得ORF2基因。分別構(gòu)建PA與PCV2-Cap N端和C端相連的兩種融合基因的重組質(zhì)粒pQZ-PA3-Cap和pQZ-Ca

7、p-PA3，利用大腸桿菌可溶性表達(dá)平臺CVC1102對融合基因進行表達(dá)。SDS-PAGE鑒定表明，獲得融合蛋白為44.6 KD，Cap-PA3表達(dá)量要遠(yuǎn)低于PA3-Cap的表達(dá)量。其中，PA3-Cap約60-70％為可溶性表達(dá)。Western-blotting分析顯示，兩種融合蛋白與豬PCV2特異性抗血清呈陽性反應(yīng)。
　　融合蛋白與GEM顆粒結(jié)合特性鑒定。取1U GEM顆粒各與2 ml Cap-PA3、PA3-Cap蛋白室溫下結(jié)合

8、，分別進行SDS-PAGE、電子顯微鏡觀察及間接免疫熒光試驗鑒定。結(jié)果表明，兩種重組蛋白均可與GEM顆粒特異性結(jié)合，結(jié)合后的GEM顆粒表面形成一層較厚的PA-Cap蛋白層，該層蛋白可與PCV2特異性熒光抗體結(jié)合。此外，本章研究還建立了GEM-PA-Cap完全解離的SDS加熱方法，用于PA3-Cap抗原定量分析。
　　3.PCV2-Cap顆?？乖庖咴猿醪窖芯?br>　　制備PA3-Cap融合蛋白，與GEM顆粒結(jié)合后，獲得PCV2

9、-GEM顆?？乖?，PA3-Cap含量為1 mg/mL。按照100μg/頭的劑量，PCV2-GEM顆?？乖謩e不同的佐劑混合乳化，獲得試驗性疫苗，4℃保存?zhèn)溆谩＿x擇2-3周齡、抗原和抗體雙陰性仔豬54只，將其分為6個實驗組和2個對照組。頸部肌肉注射免疫，免疫3周后采血，用間接ELISA試劑盒檢測抗體。結(jié)果表明， Y佐劑與L佐劑、鋁膠佐劑和206佐劑相比，與GEM-PA3-Cap抗原配合免疫產(chǎn)生的抗體水平最高。在Y佐劑中添加免疫增強劑CVC