適用于單子葉植物的LIC載體的構(gòu)建及動物抗菌肽在水稻抗病育種中的應(yīng)用.pdf

1、在過去的幾十年間，研究人員用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了多種轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)化法依賴于農(nóng)桿菌中存在的Ti質(zhì)粒。目前應(yīng)用較多的是傳統(tǒng)雙元載體和Gateway系統(tǒng)，但是傳統(tǒng)雙元載體使用時(shí)較復(fù)雜浪費(fèi)時(shí)間，而Gateway系統(tǒng)雖然使用方便但是價(jià)格較昂貴，并未大量采用。在使用傳統(tǒng)雙元載體時(shí)經(jīng)常會遇到多種問題:酶切位點(diǎn)不合適、同時(shí)連入多條片段困難等。而LIC雙元載體可以彌補(bǔ)這些不足，并且使用價(jià)格便宜，但是用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的LIC雙元載體并沒有得到發(fā)展。

2、r>　　 因此，本文以pCAMBIA和pGA系列載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了一組用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的LIC雙元載體，可用于基因表達(dá)分析、蛋白定位分析和啟動子功能分析。這是一組可以快速構(gòu)建的載體，且使用價(jià)格便宜。這套載體使用時(shí)不需要考慮多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)是否合適，任何片段只須加15bp的特異接頭即可連入載體，且每套載體均有Bar和Hyg兩種抗性標(biāo)記基因，所以同一基因可以同時(shí)連入兩個(gè)載體用于不同植物的轉(zhuǎn)化。并且，這套載體用于菌體篩選的抗性標(biāo)記基因

3、是Kan抗性基因，Kan相對穩(wěn)定，篩選效率高，使用方便有效。這組載體為以后的順利實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 植物基因工程是水稻抗病育種的重要方式，這種方式可以在不改變水稻原始性狀的基礎(chǔ)上使轉(zhuǎn)基因植株獲得預(yù)想的抗性性狀。為了提高植物的抗病性，不同來源的抗性基因以被轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物，包括植物本身的抗病通路的基因，以及來源于植物和非植物的抗菌肽基因?？咕木哂歇?dú)特的抗菌機(jī)制，且具有廣譜抗菌性，能作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞，但是對正常的

4、真核細(xì)胞幾乎沒有作用，且不易產(chǎn)生耐藥性。將抗菌肽基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物使植物獲得抗病性已有較多的成功例子。
　　 本文首先通過對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行優(yōu)化，使轉(zhuǎn)化效率得到了較大的提高。將來源于中國明對蝦的三種抗菌肽基因(ALF、WAP、Penaeidin)轉(zhuǎn)化水稻，經(jīng)檢測，分別獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株5、7、2棵，經(jīng)PCR擴(kuò)增、SouthernBlot雜交驗(yàn)證與抗除草劑表型鑒定分析，證明目的基因穩(wěn)定存在于T1代轉(zhuǎn)基因植株基因組中?；诳咕牡?/p>