雙抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化歐美楊107楊的研究.pdf

1、楊樹(shù)在全球分布十分廣泛,是重要的造林樹(shù)種和生態(tài)防護(hù)林樹(shù)種。其樹(shù)干通直,樹(shù)形優(yōu)美,是很好的園林綠化樹(shù)種,廣泛應(yīng)用于園林中,通常做植物造景樹(shù)和景觀背景樹(shù)。楊樹(shù)由于其速生性以及高度的觀賞價(jià)值在園林綠化和經(jīng)濟(jì)林中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用,然而,近年來(lái),病蟲(chóng)害的侵犯也造成了重大的損失。轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因歐美楊107楊的獲得不但能有效地解決楊樹(shù)的蟲(chóng)害問(wèn)題,而且該樹(shù)種的速生性也將使其成為園林綠化應(yīng)用的首選樹(shù)種,轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因歐美楊107楊的獲得不管是從社會(huì)需求

2、還是從經(jīng)濟(jì)效益上考慮,它的研發(fā)和培育都是必要的。目前,在楊樹(shù)的眾多樹(shù)種中,只有白楊派樹(shù)種在組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面相對(duì)成熟。本試驗(yàn)主要采用農(nóng)桿介導(dǎo)法將構(gòu)建在一個(gè)載體上的雙抗蟲(chóng)基因(BtCrylAc基因+API慈姑蛋白酶抑制劑基因)對(duì)歐美楊107楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究,并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了分子生物學(xué)檢測(cè)和初步飼蟲(chóng)試驗(yàn),獲得了轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因的歐美楊107楊株系。
　　 (1)針對(duì)影響歐美楊107楊的遺傳轉(zhuǎn)化的不同因素,初步建立了歐美楊107

3、楊品種高效組織培養(yǎng)再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系,以材料的莖段和葉片為外植體,通過(guò)篩選獲得最佳分化培養(yǎng)基,建立了其穩(wěn)定高效的再生體系,結(jié)果表明:不定芽誘導(dǎo)分化最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.15mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L,確定生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.5mg/L+蔗糖15g+瓊脂7g/L。同時(shí)研究結(jié)果表明:葉片主葉脈及葉柄和莖段傷口處發(fā)芽狀況相似,因此選取葉片或莖段作為試驗(yàn)材料對(duì)本次試驗(yàn)影響不大。

4、　　 (2)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化,對(duì)影響轉(zhuǎn)化的各個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明:在浸菌15min,共培養(yǎng)3d,得到抗性芽,誘導(dǎo)率為16.7％。經(jīng)過(guò)卡那霉素的篩選,生根培養(yǎng),煉苗和移栽,獲得抗性植株。
　　 (3)根據(jù)PCR分析及ELISA毒蛋白檢測(cè)結(jié)果,證明Bt基因和蛋白酶抑制劑基因已經(jīng)整合到歐美楊107楊基因組DNA中。通過(guò)本試驗(yàn)的研究,獲得了轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因的歐美楊107楊10個(gè)系號(hào),其中10個(gè)系號(hào)進(jìn)行PCR檢測(cè)都為陽(yáng)

5、性,ELISA檢測(cè)10個(gè)系號(hào)中毒蛋白含量測(cè)定占總蛋白最高表達(dá)量為0.0336%。
　　 (4)用轉(zhuǎn)基因歐美楊107楊的幼嫩葉片喂養(yǎng)美國(guó)白蛾1齡幼蟲(chóng)的蟲(chóng)試結(jié)果表明,轉(zhuǎn)雙抗蟲(chóng)基因歐美楊107楊對(duì)幼蟲(chóng)的毒殺率明顯高于對(duì)照未轉(zhuǎn)基因楊樹(shù),6個(gè)編號(hào)的植株葉片被美國(guó)白蛾取食后,其中4個(gè)號(hào)系死亡率能達(dá)到100%。說(shuō)明這2個(gè)基因在植物細(xì)胞內(nèi)均能夠有效地表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒性。
　　 (5)經(jīng)分子生物學(xué)檢測(cè)和蟲(chóng)試效果,