轉(zhuǎn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白基因山新楊抗逆性分析.pdf

1、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白是植物體內(nèi)一種重要的防御蛋白,在抵抗和適應(yīng)外界脅迫中有著重要的作用。本實驗室已成功建立了在0.4 mol/L的NaCl溶液脅迫條件下剛毛檉柳根的cDNA文庫,通過對檉柳cDNA文庫克隆的隨機測序,獲得的ThLTP基因的cDNA序列,全長635 bp,其中5'非編碼區(qū)129 bp,3'非編碼區(qū)155 bp,開放閱讀框(ORF)為351 bp,編碼116個氨基酸。
　　 采用熒光定量PCR技術(shù)探討了ThLTP在鹽脅迫、冷

2、脅迫、干旱脅迫、重金屬脅迫以及ABA誘導(dǎo)條件下的表達(dá)模式,結(jié)果證明:ThLTP基因能夠?qū)aCl、ABA、PEG和重金屬隔(Cd)脅迫產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng),顯著呈上調(diào)表達(dá),并且其在根中的表達(dá)量明顯高于地上組織中的表達(dá)量;而冷脅迫則抑制了該基因在檉柳根中的表達(dá)。因而我們推測ThLTP是一個NaCl、PEG和重金屬隔(Cd)逆境脅迫相關(guān)的基因,其表達(dá)受ABA誘導(dǎo)。
　　 將ThLTP構(gòu)建原核表達(dá)載體,進(jìn)行該基因的原核表達(dá)研究,建立了最佳原核

3、表達(dá)體系,即30℃條件下0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h,重組菌株BL21(pET32a-LTP)表達(dá)量達(dá)到最高。進(jìn)而對重組菌株BL21(pET32a-LTP)進(jìn)行了逆境脅迫。結(jié)果表明,在NaCl和PEG脅迫條件下的生長曲線分析表明,重組菌株BL21(pET32a-LTP)能顯著提高大腸桿菌抵御非生物脅迫的能力,證實ThLTP是一個與抗旱耐鹽相關(guān)的基因。
　　 為了進(jìn)一步驗證ThLTP在鹽脅迫下的功能,將ThLTP基因用

4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化山新楊,共獲得卡那霉素抗性株系20個,其中有10個株系經(jīng)PCR驗證為陽性。從10個株系中選擇9個株系(S7、S9、S12、S13、S14、S15、S19、S30、S44)做進(jìn)一步Northern檢測,結(jié)果證明該基因已成功地整合到山新楊基因組中,并轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的產(chǎn)物。將轉(zhuǎn)基因山新楊和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓攴謩e接種到含有0 mmol/L、50 mmol/L、100mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L NaCl的培

5、養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后,過量表達(dá)ThLTP的轉(zhuǎn)基因山新楊植株生長狀態(tài)好于對照植株。對200 mmol/L NaCl脅迫下葉片分化率、平均增重、生根率、鹽害指數(shù)的綜合分析得出,抗鹽性從強倒弱排序:S14＞S19＞S9＞S30＞S12＞S7＞S44＞CK。轉(zhuǎn)基因植株葉片抗鹽迫分析表明,0.8％NaCl脅迫3 d、4 d后各轉(zhuǎn)基因株系葉綠素含量顯著地高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~綠素含量,其平均值高于對照的79.3％;各轉(zhuǎn)基因株系相對電導(dǎo)率顯著低于非轉(zhuǎn)