蘋果MhGAI1、MdMIR156和MdMIR172基因的功能鑒定.pdf

1、DELLA蛋白是植物生長的阻遏因子，在植物體內(nèi)，該蛋白在GA信號誘導(dǎo)下被蛋白酶體降解，從而解除生長遏制作用；如果DELLA結(jié)構(gòu)域的重要氨基酸序列發(fā)生改變，DELLA蛋白就不能被GA信號誘導(dǎo)降解，從而組成型遏制植物生長，使植株表現(xiàn)出GA不敏感型矮化。本研究通過對蘋果DELLA蛋白編碼基因MhGAI1的分子克隆和功能鑒定，闡明其在矮化性狀形成中的作用，并展示其在蘋果矮化砧木分子育種中的應(yīng)用潛力。
　　 miRNAs在植物生長發(fā)育、逆

2、境脅迫適應(yīng)等過程中起重要調(diào)控作用。擬南芥miR156和miR172通過特異剪切靶基因的轉(zhuǎn)錄本，對植物體生長發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。本研究從蘋果中分別克隆了miR156和miR172的轉(zhuǎn)錄前體序列及其靶基因序列，并通過在擬南芥中的異位表達(dá)等手段鑒定了它們的生物學(xué)功能。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.MhGAI1基因在不同器官中均有表達(dá)，但表達(dá)水平不同，在莖和幼葉的表達(dá)量較低，在老葉、花和果實(shí)中表達(dá)量較高。
　　 2.構(gòu)

3、建了MhGAI1的亞細(xì)胞定位載體，侵染洋蔥表皮細(xì)胞后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)MhGAI1蛋白定位于細(xì)胞核：構(gòu)建了MhGAI1的原核表達(dá)載體，并成功誘導(dǎo)出約75 kDa的His-MhGAI1蛋白。
　　 3.構(gòu)建了DELLA功能域點(diǎn)突變的過量表達(dá)載體p35S：△MhGAI1，并成功轉(zhuǎn)化王林愈傷組織，GA處理后提取愈傷組織蛋白并用anti-MhGAI1作抗體進(jìn)行Western檢測，結(jié)果顯示，王林愈傷組織中DELLA蛋白GA處理

4、后降解，△MhGAI1過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中△MhGAI1蛋白在GA處理前后無差異。
　　 4.△MhGAI1轉(zhuǎn)基因番茄植株矮化，莖和側(cè)枝節(jié)間長度變短，葉片、花、果實(shí)和種子變小，自然結(jié)實(shí)率和單性結(jié)實(shí)率下降。另外轉(zhuǎn)基因番茄中可溶性固形物、蘋果酸、酒石酸和可溶性糖含量均高于野生型。
　　 5.用轉(zhuǎn)基因番茄作砧木嫁接野生型接穗，RT-PCR在野生型接穗中檢測到了△MhGAI1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，表明砧木中的△MhGAI1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以

5、通過嫁接口運(yùn)輸?shù)浇铀胫小z測部位距離嫁接口位置越遠(yuǎn)，檢測到的△MhGAI1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物豐度越低。Western雜交也在接穗中檢測到了GA不敏感的DELLA蛋白，表明△MhGAI1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)浇铀牒竽芊g成蛋白。野生型接穗表現(xiàn)出矮化特性，節(jié)間長度明顯變短，節(jié)間長度與其到嫁接口的距離呈負(fù)相關(guān)?！鱉hGAI1在轉(zhuǎn)基因株系的莖、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)；但是只在野生型接穗的莖和葉片中檢測到△MhGAI1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而在果實(shí)中沒有，所以，△MhGAI

6、1轉(zhuǎn)基因砧木對接穗的果實(shí)品質(zhì)影響不大。
　　 6.從蘋果中克隆到兩條MdMIR172基因及其靶基因MdAP2，與擬南芥miR172家族序列對比后，將兩條MdMIR172基因分別命名為Md-MIR172a-b和Md-MIR172e。共注射煙草研究表明，Md-miRl72e能抑制MdAP2的表達(dá)并使其蛋白表達(dá)量減少。構(gòu)建過量表達(dá)p35S：Md-MIR172e并侵染擬南芥，Md-MIR172e和Md-miR172e過量積累的轉(zhuǎn)基因植株

7、中，miR172的靶基因AtAP2在轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]變化，而AtTOE1，AtTOE3和AtSMZ表達(dá)量下調(diào)。轉(zhuǎn)基因植株花期提前，并且花器官發(fā)育異常。
　　 7.從蘋果中克隆到MdMIR156基因，與擬南芥miR156家族序列比對后將其命名為為Md-MIR156h。從蘋果EST庫中比對拼接，得到含Md-miR156h識別位點(diǎn)的3個基因片段MdSPL6、MdSPL9和MdSPL12。構(gòu)建過量表達(dá)載p35S：Md-MIR156h并侵染擬南