柔嫩艾美耳球蟲比較蛋白組及免疫蛋白組研究.pdf

1、雞柔嫩艾美耳球蟲是艾美耳屬最重要的蟲種之一，它能專一性感染雞。雞感染球蟲后，輕則造成體重減輕，肉料比下降并且并發(fā)血便；重則使雞大批死亡，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 柔嫩艾美耳球蟲的某些專一性蛋白在寄生蟲發(fā)育的特定階段發(fā)揮著重要的作用。我們采用二維電泳方法，使用pH3-10線性膠條對柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊和孢子化卵囊兩個時期的可溶性蛋白進(jìn)行了比較分析。凝膠通過考馬斯亮藍(lán)G-250染色并用ImageMasterTM圖像分

2、析軟件分析，發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲卵囊蛋白豐度和種類在孢子化過程中發(fā)生了較大變化。選擇18個在兩個時期均出現(xiàn)的蛋白點；15個只在未孢子化卵囊階段出現(xiàn)的蛋白點和21個僅出現(xiàn)于孢子化卵囊階段的蛋白點通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption ionization time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）和串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-T

3、OF-MS)分析，將分析結(jié)果利用‘Mascot'server和‘Mascot in house'search engine，分別通過NCBI數(shù)據(jù)庫和柔嫩艾美耳球蟲蛋白序列數(shù)據(jù)庫檢索。有43個蛋白點能檢索到柔嫩艾美耳球蟲已知或與復(fù)頂門其它寄生蟲或四膜蟲具有同源性的蛋白。其中烯醇酶、肌動蛋白解聚因子、核糖體蛋白大亞基和19Kd子孢子抗原在未孢子化卵囊階段豐度小于孢子化卵囊階段，而乳酸脫氫酶豐度在未孢子化卵囊階段高于孢子化卵囊階段。柔嫩艾美耳

4、球蟲的丙酮酸激酶、假定蛋白、甘露醇磷酸化酶、天冬氨酸蛋白酶和14-3-3蛋白以及7個與復(fù)頂門其它寄生蟲或四膜蟲具有同源性的蛋白僅發(fā)現(xiàn)于未孢子化卵囊階段，它們包括間日瘧原蟲假定蛋白和6－磷酸果糖激酶、四膜蟲多腺苷酸結(jié)合蛋白、隱孢子蟲蛋白酶亞基、環(huán)形泰勒蟲假定分泌蛋白、弓形蟲真核轉(zhuǎn)錄起始因子等。僅存在于柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊階段的蛋白包括子孢子抗原、柔嫩艾美耳球蟲未知蛋白和表面抗原10等已知的柔嫩艾美耳球蟲蛋白和4個與復(fù)頂門其它寄生蟲或四

5、膜蟲具有同源性的蛋白。它們包括四膜蟲胞質(zhì)動力蛋白、假定蛋白、膜骨架蛋白等。
　　 采用比較蛋白組學(xué)研究方法，選擇柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊和第二代裂殖子兩個階段的可溶性蛋白進(jìn)行二維電泳分析，構(gòu)建了穩(wěn)定的二維電泳參考圖譜。凝膠經(jīng)染色和圖像分析，發(fā)現(xiàn)在兩個時期凝膠上平均分布有678、660個蛋白點。有14個蛋白點在兩個時期均恒定表達(dá)。8個蛋白點經(jīng)分析和數(shù)據(jù)庫檢索后鑒定為包括乳酸脫氫酶、19KD子孢子抗原、微線蛋白－2、烯醇酶和肌動蛋白

6、解聚因子在內(nèi)的已知柔嫩艾美耳球蟲蛋白和1個與環(huán)形泰勒蟲蛋白酶亞基具有同源性的蛋白。
　　 為了進(jìn)一步了解柔嫩艾美耳球蟲的免疫機(jī)制，本實驗采用了免疫蛋白組學(xué)的方法，對柔嫩艾美耳球蟲生活史中三個不同階段的可刺激宿主產(chǎn)生抗體的蛋白分別進(jìn)行了篩選，以期發(fā)現(xiàn)新的免疫原性蛋白。
　　 運用免疫蛋白組學(xué)方法鑒定了柔嫩艾美爾球蟲未孢子化卵囊具免疫原性蛋白。約101個蛋白點被雞抗柔嫩艾美耳球蟲血清識別。根據(jù)其中46個蛋白點分析結(jié)果，有14

7、個蛋白點被鑒定為柔嫩艾美爾球蟲已知蛋白，這些蛋白包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、肌動蛋白解聚因子、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白、丙酮酸激酶、β微管蛋白、柔嫩艾美耳球蟲假定蛋白、子孢子抗原等。17個蛋白點鑒定為與復(fù)頂門其它寄生蟲或草履蟲和四膜蟲具有同源性的蛋白（包括堆型艾美耳球蟲熱休克蛋白、草履蟲假定蛋白、瘧原蟲假定蛋白和6-磷酸果糖激酶等）。將剩余蛋白點的分析數(shù)據(jù)通過‘Mascot in house’(version2.1) search engin

8、e利用柔嫩艾美爾球蟲蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，檢索到12個未知的推測蛋白。將該蛋白氨基酸序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)9個與復(fù)頂門其他寄生蟲具有同源性的蛋白。它們包括：弓形蟲3-磷酸甘油醛脫氫酶、真核生物翻譯起始因子和肌球蛋白A；間日瘧原蟲SNF2家族N末端封閉蛋白；牛巴貝斯蟲肌球蛋白B和延胡索酸酶；環(huán)形泰勒蟲假定分泌蛋白；小泰勒蟲丙酮酸脫氫酶β亞基和隱孢子蟲蛋白酶亞基等。
　　 采用免疫蛋白組學(xué)方法以人工感染雞柔嫩艾美耳球蟲制備的高

9、免血清為一抗，對雞柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊可溶性蛋白的免疫原性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。約有80個具有免疫原性的蛋白點被抗血清識別。選擇其中PVDF膜與凝膠匹配完全的40個點經(jīng)質(zhì)譜分析和NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，有22蛋白點鑒定為柔嫩艾美耳球蟲已知蛋白，包括乳酸脫氫酶、烯醇酶、14-3-3蛋白、微線蛋白、微管蛋白、子孢子抗原、表面抗原10、微線蛋白3、柔嫩艾美耳球蟲未知蛋白、烯醇?；€原酶和轉(zhuǎn)氫酶等；另外還發(fā)現(xiàn)8個和復(fù)頂門其它寄生蟲或草履蟲具有同源性的

10、蛋白，包括堆型艾美耳球蟲RB1-a未知蛋白、隱孢子蟲二氫葉酸還原酶合成酶以及草履蟲假定蛋白等。將剩余的10個蛋白點分析數(shù)據(jù)通過柔嫩艾美耳球蟲蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析，8個由柔嫩艾美耳球蟲基因組序列推測的未知蛋白被成功鑒定。將檢測結(jié)果氨基酸序列比對（NCBI數(shù)據(jù)庫），發(fā)現(xiàn)3個其它蟲種蛋白與未知蛋白具有較高同源性，包括瘧原蟲ATP合成酶、弓形蟲肌球蛋白A和絲盤蟲的假定蛋白等。序列數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)11個由柔嫩艾美耳球蟲基因組序列推測的未知蛋白