CSFV-BVDV雙重?zé)晒釸T-PCR檢測(cè)方法的建立與山東地區(qū)CSFV的分子生物學(xué)研究.pdf

1、豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高度接觸性致死性傳染病，現(xiàn)階段，豬瘟的防控通常采用豬瘟兔化弱毒疫苗（C株）進(jìn)行接種預(yù)防，該疫苗是世界上公認(rèn)的最有效和安全的弱毒疫苗，對(duì)豬瘟的防控起到了重要的作用。然而，在免疫良好的豬場(chǎng)仍有豬瘟的病例的發(fā)生，CSFV與牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，B

2、VDV)同屬于黃病毒科、瘟病毒屬，存在抗原相關(guān)性和交叉反應(yīng)性，兩者自然條件下感染豬，其臨床癥狀和病理變化相似，加大了臨床診斷的困難。為了解山東地區(qū)CSFV的流行狀況和更好地進(jìn)行CSFV的監(jiān)測(cè)，本試驗(yàn)建立了雙重?zé)晒釸T-PCR（RT-qPCR）檢測(cè)方法，并對(duì)成功分離的CSFV的C、E0、E1基因和E2部分基因進(jìn)行了克隆測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析。
　　為建立CSFV和BVDV的鑒別檢測(cè)方法，根據(jù)Genbank公布的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和T

3、aqMan探針，以構(gòu)建的CSFV Npro和BVDV5′-UTR的陽性重組質(zhì)粒作為陽性質(zhì)控品，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了雙重RT-qPCR檢測(cè)方法。以陽性質(zhì)控品和常見病毒為模板進(jìn)行了特異性、靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn)，并應(yīng)用于臨床檢測(cè)。結(jié)果，CSFV和BVDV的檢測(cè)靈敏度均為100拷貝/μl，特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好。應(yīng)用所建立的RT-qPCR方法和本實(shí)驗(yàn)室常用單項(xiàng)CSFV RT-qPCR試劑盒和單項(xiàng)BVDV RT-qPCR試劑盒對(duì)本實(shí)驗(yàn)室2016年采集的

4、206份豬病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CSFV陽性59份、BVDV皆為陰性，與常用單項(xiàng)CSFV和BVDV RT-qPCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。本研究建立的雙重RT-qPCR整個(gè)檢測(cè)過程不到3h，采取閉管反應(yīng)，檢測(cè)完畢直接處理，避免開蓋造成氣溶膠污染，具有簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、生物安全性好等優(yōu)點(diǎn)，可用于CSFV和BVDV的臨床鑒別檢測(cè)，且BVDV-1和BVDV-2皆能檢出，為2種病毒的交叉污染的檢測(cè)提供一種方便、快捷的方法。
　　本研究采取

5、體外培養(yǎng)技術(shù)，選取來自濟(jì)南、德州、臨沂、泰安、日照、淄博、濟(jì)寧等地區(qū)的26份CSFV陽性病料接種PK15細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，成功分離了26株CSFV，分別命名為SDJN-1、SDJN-2、SDJN-3、SDJN-4、SDJN-5、SDDZ-1、SDDZ-2、SDDZ-3、SDQH-1、SDQH-2、SDQH-3、SDQH-4、SDQH-5、SDQH-6、SDQH-7、SDXJ-1、SDXJ-2、SDXJ-3、SDLY-1、SDLY-2、S

6、DRZ-1、SDZB-1、SDTA-1、SDTA-2、SDSS-1、SDLS-1。采用豬瘟野毒熒光RT-PCR試劑盒對(duì)26株分離株進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明其皆為野毒株。
　　采用分子克隆技術(shù)對(duì)已分離的26株CSFV C、E0、E1基因和E2部分基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，并利用DNAStar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接并分析，同源性分析發(fā)現(xiàn)，26株分離株之間核苷酸和推導(dǎo)氨基酸同源性都很高，分別為為91.1％-99.2%、93.8%-9

7、9.6%，與其他毒株同源性最低的是SDJN-3；與Shimen、HCLV、pardarborn、HEBZ等8株經(jīng)典豬瘟毒株比較，核苷酸同源性為83.8%-96.2%和氨基酸同源性為88.6%-97.6%；利用MEGA6軟件對(duì)26株分離株與8株已知參考毒株序列進(jìn)行比較，繪制系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)，所比較的34株分離株分為2個(gè)分支，Shimen株、HCLV疫苗株與Brescia株組成一支為1群；其他毒株為一支組成2群，其中26株分離株與Parder