三株P(guān)RRSV的生物學(xué)特性、全基因組測(cè)序及PRRSV-JSyx-2006株全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、2006年夏季我國(guó)出現(xiàn)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)其主要特征是編碼Nsp2蛋白的基因發(fā)生了90個(gè)堿基的缺失，且不同地區(qū)的缺失分離株具有高度的同源性。具有該特征的PRRSV被認(rèn)為是導(dǎo)致2006年豬高熱病病豬大批死亡的原因。 為確認(rèn)具有該基因特征的PRRSV的致病性，本研究選取具有時(shí)間代表性的PRRSV/Chang

2、zhou/2005、PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株進(jìn)行生物學(xué)特性研究和基因組全序列測(cè)定，比較其毒力與序列方面的相關(guān)性。 3株病毒感染Marc-145細(xì)胞能夠產(chǎn)生相同的細(xì)胞病變，特異的Nsp2引物進(jìn)行RT-PCR，PRRSV/JSyx/2006/株和PRRSV/Yangzhou/2008株均為Nsp2缺失毒株；測(cè)序發(fā)現(xiàn)PRRSV/Changzhou/2005毒株為Nsp2缺失3個(gè)堿基毒株。

3、 動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明，PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株能夠引起試驗(yàn)仔豬產(chǎn)生皮膚發(fā)紺等典型的PRRS病變，比PRRSV/Changzhou/2005株攻毒豬的病變嚴(yán)重；且體溫升高的幅度和發(fā)熱維持的時(shí)間也比后者明顯。 盡管Nsp2缺失株攻毒豬產(chǎn)生明顯的病變以及體溫升高，在發(fā)熱期間食欲有所下降，但試驗(yàn)豬體表病變?cè)诠ザ竞?0 d左右均結(jié)痂脫落，且體溫在攻毒后10 d左右恢復(fù)正常，未出現(xiàn)豬的死

4、亡。 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PRRSV保守序列，設(shè)計(jì)了基因組全序列擴(kuò)增引物，對(duì)這3株病毒進(jìn)行基因組全序列測(cè)定，并與GenBank中已發(fā)表序列進(jìn)行對(duì)比分析。 通過(guò)全基因組的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PRRSV/JSyx/2006株和PRRSV/Yangzhou/2008株編碼Nsp2蛋白區(qū)域均有90個(gè)堿基的不連續(xù)缺失，分別在基因組第2778～2780位缺失了3個(gè)堿基(編碼一個(gè)苯丙氨酸)和在2947～3033位缺失了87個(gè)堿基(編碼2

5、7個(gè)氨基酸)。值得注意的是PRRSV/Changzhou/2005株Nsp2的區(qū)域上述位點(diǎn)只有3個(gè)堿基的缺失。 通過(guò)分子發(fā)生樹分析，我國(guó)大陸分離株明顯分為兩個(gè)分支，CH-1a、HB-1、PRRSV/Changzhou/2005、PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株同屬一個(gè)分支，且PRRSV/JSyx/2006和PRRSV/Yangzhou/2008株與其他省份分離的變異株具有高度的同源性，其堿

6、基突變位點(diǎn)一致。 本研究在全基因組序列測(cè)定的基礎(chǔ)上，根據(jù)相應(yīng)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)8對(duì)引物，利用RT-PCR方法擴(kuò)增出覆蓋PRRSV/JSyx/2006株基因組的8個(gè)cDNA片段，分步將全長(zhǎng)cDNA克隆入pCR()2.1載體，最終通過(guò)酶切將含有PRRSV/JSyx/2006株全長(zhǎng)cDNA的片段克隆到pCMVmcl載體中，完成PRRSV/JSyx/2006基因組全長(zhǎng)感染性cDNA克隆pCMV-PRRSV/JSyx/2006的構(gòu)建，通過(guò)轉(zhuǎn)染M