球孢白僵菌幾丁質酶超表達及雙價轉基因工程菌株的構建及毒力評價.pdf

1、球孢白僵菌是最常見的蟲生真菌之一，其寄主范圍廣，易大量生產，已開發(fā)為真菌殺蟲劑在害蟲生物防治中廣泛應用。然而，球孢白僵菌和其它蟲生真菌一樣，具有殺蟲慢的重大缺陷。為此人們一直在潛心研究蟲生真菌的分子致病機制，以尋找可通過基因工程手段進行改造的基因。幾丁質酶在蟲生真菌穿透寄主體壁的過程中起一定作用，但其與真菌毒力的關系尚不清楚。本研究將外源的球孢白僵菌幾丁質酶基因Bbchit1分別轉入兩個出發(fā)菌株：含有該基因的球孢白僵菌野生型菌株RCEF

2、0013，以及將北非蝎（Androctonus australis）昆蟲特異性神經(jīng)毒素多肽基因AaIT轉入RCEF0013后獲得的一價轉基因工程菌株RCEF0013-A，從而構建成一個雙拷貝的幾丁質酶超表達轉基因工程菌株和一個蝎毒-幾丁質酶雙價轉基因工程菌株。
　　 本實驗首先構建了含有篩選標記bar基因和外源幾丁質酶基因Bbchit1的載體pbar-GPE1-Bbchit1,通過芽生孢子法將載體質粒轉入該野生型出發(fā)株RCEF0

3、013，在加入草胺磷（100μg/ml）[1]的SDAY培養(yǎng)基上篩選獲得轉化子，構建成一個雙拷貝的工程菌株RCEF0013-C。再以pbarGPE1-Bbchit1質粒為中間載體，擴增出含有強啟動子、終止子及Bbchit1基因的GpdA-Bbchit1-TrpC基因片段，將GpdA-Bbchit1-TrpC基因片段插入pbenGPS3質粒中，構建成一個含有篩選標記ben基因和Bbchit1基因的新質粒pbenGPS3-Bbchit1。將

4、pben GPS3-Bbchit1質粒用芽生孢子法轉入含有外源蝎毒基因AaITd的一價轉基因工程菌株RCEF0013-A中，在加入苯菌靈（2μg/ml）[1]的SDAY培養(yǎng)基上篩選獲得轉化子，構建成一個雙價的轉基因工程菌株RCEF0013-A-C。幾丁質酶酶活測定結果表明，轉化子菌株RCEF0013-C在膠體幾丁質誘導培養(yǎng)基中酶活最大值高于野生型菌株的4.2倍，從而使該幾丁質酶基因在轉化的菌株中得到超表達。
　　 對馬尾松毛蟲（

5、Dendrolimus punctatus）進行生物測定的結果顯示，超量表達雙拷貝的Bbchit1轉基因及AaIT和Bbchit1雙價轉基因均能顯著地提高重組菌株的毒力。對馬尾松毛蟲幼蟲進行生物測定的結果表明，轉化子RCEF0013-C（4.53×105conidia/ml）的致死中濃度比出發(fā)株RCEF0013（2.93×106 conidia/ml）降低5.46倍。致死中量（17.6conidia/m㎡）比出發(fā)株（113.9 coni

6、dia/m㎡）減少5.47倍，致死中時（5.86天）比出發(fā)株（6.58天）縮短0.7天。這表明，幾丁質酶基因超表達的球孢白僵菌雙拷貝的工程株的毒力有了顯著的提高。轉化子RCEF0013-A-C（1.60×105conidia/ml）的致死中濃度比出發(fā)株RCEF0013（2.93×106conidia/ml）降低17.31倍。致死中量（6.54conidia/mg）比出發(fā)株（113.9 conidia/mg）減少16.41倍，致死中時（4