棉鈴蟲細(xì)胞色素P450基因CYP9A17v2啟動子活性分析.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hubner）是一種世界性的重要經(jīng)濟(jì)害蟲，其發(fā)生和危害嚴(yán)重影響到棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量。由于長期采用化學(xué)防治，棉鈴蟲對多種化學(xué)藥劑尤其是擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性.細(xì)胞色素P450基因的過量表達(dá)導(dǎo)致解毒代謝增強(qiáng)是棉鈴蟲對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性的主要機(jī)理。屬于CYP9和CYP6家族的多個P450基因的過量表達(dá)已被證實與棉鈴蟲對殺蟲劑的解毒代謝有關(guān)。本文對棉鈴蟲P450基因CYP9A12，CYP

2、gA17v2的5’-調(diào)控區(qū)進(jìn)行了擴(kuò)增，并采用報告基因技術(shù)對CYP9A17v2核心啟動子區(qū)進(jìn)行了缺失分析，以期找出其過量表達(dá)的調(diào)控機(jī)理，同時對CYP9家族基因（CYP9A12，CYP9A14，CYP9A17v2）和CYP6家族基因（CYP687）的編碼區(qū)cDNA多態(tài)性進(jìn)行了分析。
　　 1.棉鈴蟲細(xì)胞色素P450基因CYP9A12和CYP9A17v25’-調(diào)控區(qū)克隆和序列分析
　　 細(xì)胞色素P450基因CYP9A12和CY

3、P9A17v2的過量表達(dá)和棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)。以YG和YGF品系基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序，獲得CYP9A125’-調(diào)控區(qū)序列約2.6kb，CYP9A17v25’-調(diào)控區(qū)序列約3.4klb。通過BDGP在線分析軟件預(yù)測出各基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，并利用日本京都大學(xué)KEGG序列數(shù)據(jù)庫MOTIF檢索分析服務(wù)系統(tǒng)預(yù)測出上游啟動子區(qū)域內(nèi)兩個基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。通過對棉鈴蟲抗性和對照品系中這兩個基因5’-調(diào)控區(qū)的克隆和

4、序列分析，為下一步研究棉鈴蟲P450基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 2.棉鈴蟲細(xì)胞色素P450基因CYPgA17v2核心啟動子區(qū)缺失分析
　　 CYP9A17v2的過量表達(dá)與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性相關(guān)。為了研究CYP9A17v2表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對CYP9A17v2核心啟動子區(qū)域的功能進(jìn)行了分析。構(gòu)建了含熒光素酶報告基因（1uc）和CYP9A17v2啟動子不同長度缺失片段（-1095～+43）的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)

5、染sf9細(xì)胞瞬時表達(dá)后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測啟動子活性。功能分析的結(jié)果表明：所有構(gòu)建的7個缺失片段均具有啟動子活性，-197～+43啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性最高。在CYP9A17v2基因5’-調(diào)控區(qū)-197～.113區(qū)域內(nèi)可能存在轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子的結(jié)合位點，而在-1095～-197區(qū)域內(nèi)可能存在轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)合位點。本研究為探索棉鈴蟲CYP9A17v2過量表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。
　　 3.棉鈴蟲擬除蟲菊酯抗性相關(guān)

6、細(xì)胞色素P450基因多態(tài)性分析
　　 CYP9家族基因（CYP9A12、CYP9A14、CYP9A17v2）和CYP6家族基因（CYP687）均與棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān).本研究對棉鈴蟲擬除蟲菊酯抗性品系YGF、抗性對照品系YG、敏感品系SCD、田問品系GY中這四個基因的全長cDNA序列進(jìn)行了克隆和比較。其開放閱讀框均存在單核苷酸多態(tài)性位點，導(dǎo)致多個位點的氨基酸替換，在P450較為保守的血紅素結(jié)合區(qū)和螺旋K保守區(qū)等區(qū)域