農(nóng)業(yè)科學(xué)樺褐孔菌培養(yǎng)條件的研究

1、<p>　　樺褐孔菌培養(yǎng)條件的研究</p><p>　　胡亞鵬1，郭勝利2，楊淑慎3</p><p>　　（1、陜西眾興高科生物科技有限公司, 2、潤盈生物（楊凌）有限公司，3、西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院，陜西 楊凌 712100）</p><p>　　摘要：對樺褐孔菌菌絲生長的營養(yǎng)需求及發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，固體培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基為最佳配方；

2、發(fā)酵試驗(yàn)確定最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為玉米漿，合適的碳氮源配比為葡萄糖2%，玉米漿1%。同時對發(fā)酵瓶接種方法和接種量進(jìn)行對比試驗(yàn)，確定菌懸液接種法效果好，適宜接種量為2%。這些結(jié)果將為樺褐孔菌進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：樺褐孔菌；固體培養(yǎng)；碳源；氮源；碳氮比；接種量</p><p>　　Research of the Fermentation Condition

3、s for Fuscoporia obliquus (Pers:Fr.) Aoshima</p><p>　　Hu Ya-peng1，Guo Sheng-li2，Yang Shu-shen3</p><p>　　（1、Shannxi Zhongxing Gaoke Biotechnology Co.,Ltd. 2、Growing Bio（YangLing） Co., Ltd, 3、Nort

4、hwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100）</p><p>　　Abstract：Studied the nutritional needs and fermentation conditions of Fuscoporia obliquus (Pers:Fr.) Aoshima. The result show：for solid fermentatio

5、n， the best recipe is PDA medium；for liquid fermentation，the best carbon source is glucose，the best nitrogen source is corn syrup，and the best ratio of them is 2% glucose and 1% corn syrup. According the contrast experim

6、ent in transfer method and seeds volumes，it’s found that the result is good to transfer seeds with 2% seeds by the method of suspensi</p><p>　　Keyword： Fuscoporia obliqua (Pers:Fr.) Aoshima； solid fermentati

7、on；carbon source；nitrogen source； the ratio of carbon and nitrogen； transfer volumes</p><p>　　樺褐孔菌（學(xué)名Fuscoporia obliqua (Pers:Fr.) Aoshima）又名斜纖孔菌（Inonotus obliquus）、薔甘菌，在國內(nèi)的商品名為白樺茸樺褐孔菌，是一種應(yīng)用前景廣泛的珍貴藥用真菌是一種應(yīng)用前

8、景廣泛的珍貴藥用真菌。l6一l7世紀(jì)以來，東歐、俄羅斯、波蘭、芬蘭等民間廣泛利用樺褐孔菌來防治各種疑難雜癥，如各種癌癥(胃癌、肝癌、腸癌、各種消化器官癌癥)、心臟病、糖尿病 [1]。樺褐孔菌生長環(huán)境特殊，主要生長在白樺、銀樺、榆樹、赤楊的樹皮下或活立木的樹皮下或砍伐后樹木的枯干上 [2]。由于自然資源十分有限，人工栽培困難，本文采用搖瓶發(fā)酵技術(shù)，通過對樺褐孔菌生長所需的培養(yǎng)基、發(fā)酵碳氮源配比、接種方法及接種量的探索和優(yōu)化，成功獲得了樺褐

9、孔菌菌絲體，為其量產(chǎn)提供了新的途徑。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 供試菌株</b></p><p>　　樺褐孔菌（Fuscoporia obliqua (Pers:Fr.) Aoshima）由中國科學(xué)院微生物研究所提供。</p><p><

10、;b>　　1.2培養(yǎng)基</b></p><p>　　1.2.1 平板和斜面培養(yǎng)基：</p><p>　　PDA (葡萄糖)：馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g；</p><p>　　PSA (蔗糖)：馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂粉2g；</p><p>　　麩皮培養(yǎng)基：麩皮5g，葡萄糖1g，蛋白胨 0.2g，MgSO4&#

11、183;7H2O 0.075g，K2HPO4 0.1g，瓊脂粉 2g，VB1 0.3mg。</p><p>　　1.2.2 種子培養(yǎng)基：葡萄糖2g，玉米漿1g，MgSO4·7H2O 0.05g，KH2PO4 0.1g，K2HPO4 0.1g，VB10.3mg，pH 6.5~6.7。</p><p>　　1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基：分別以玉米粉，葡萄糖，蔗糖為碳源，以麩皮，黃豆餅

12、粉，玉米漿，蛋白胨酵母膏為氮源，(碳氮比2∶1) 交叉組合，添加MgSO4·7H2O 0.05g，KH2PO4 0.1g，K2HPO4 0.1g，VB10.3mg， pH 6.5~6.7。</p><p><b>　　1.3 儀器與設(shè)備</b></p><p>　　LRH-250A生化培養(yǎng)箱；HZQ-F160A型高低溫恒溫震蕩培養(yǎng)箱；KW—C旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)；W

13、S70-1型紅外線快速干燥器；D2F-1型真空干燥箱；80-2型FUHUA低速臺式大容量離心機(jī)；Scout Ⅱ電子天平；OLYMPUS CX-41生物顯微鏡；MDF-VD086S超低溫冰箱；XK96-A快速混勻器；METTLER 320 pH計； BSW-1360型超凈工作臺等。</p><p>　　1.4培養(yǎng)條件試驗(yàn)方法</p><p>　　1.4.1固體培養(yǎng)基試驗(yàn)</p>

14、<p>　　分別選用PDA (葡萄糖)培養(yǎng)基：馬鈴薯20g，葡萄糖2g，瓊脂粉2g；PSA (蔗糖)培養(yǎng)基：馬鈴薯20g，蔗糖2g，瓊脂粉2g；麩皮培養(yǎng)基：麩皮5g，葡萄糖1g，蛋白胨0.2g，MgSO4·7H2O 0.075g，K2HPO4 0.1g，瓊脂粉2g，VB10.3mg，接種至平板和斜面26℃恒溫培養(yǎng)，比較生長情況。</p><p>　　1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源組合試驗(yàn)<

15、;/p><p>　　分別以玉米粉，葡萄糖，蔗糖為碳源，以麩皮，黃豆餅粉，玉米漿為氮源[3]，(碳氮比2∶1) 交叉組合，添加MgSO4·7H2O 0.05g，KH2PO4 0.1g，K2HPO4 0.1g，VB10.3mg， PH 6.5~6.7組成發(fā)酵配方，接種搖瓶28℃，100rpm培養(yǎng)20天，過濾菌體，測定菌體干重，選擇最佳碳氮源。</p><p>　　1.4.3發(fā)酵培養(yǎng)基碳

16、氮配比試驗(yàn)</p><p>　　分別以玉米粉，葡萄糖，為碳源，以黃豆餅粉，玉米漿，蛋白胨酵母膏為氮源，設(shè)計不同碳氮比和碳氮源濃度梯度組成發(fā)酵配方，接種搖瓶28℃，100rpm培養(yǎng)20天，過濾，測定菌體干重，進(jìn)一步驗(yàn)證最佳碳氮源并確定最佳碳氮配比。</p><p>　　1.4.4接種方法的比較</p><p>　　分別將菌種用以下三種方法接種發(fā)酵培養(yǎng)基28℃，100r

17、pm，搖瓶培養(yǎng)20天，過濾，測定菌體干重，比較接種方法。</p><p>　　方法一：挖塊法，在平皿菌落上挖取1.0×0.5cm2菌體接種發(fā)酵培養(yǎng)基。</p><p>　　方法二：菌懸液法，菌懸液接種是將經(jīng)平板培養(yǎng)好的菌種加生理鹽水打碎后直接接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。</p><p>　　方法三：菌絲球接種，先將打碎后的菌懸液接入種子培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)成大小均勻的

18、菌絲球后，再將菌絲球按不同數(shù)量接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。</p><p>　　1.4.5接種量比較</p><p>　　取平皿菌體盛入裝有無菌水的三角瓶用混勻器打散制成菌懸液，以梯度劑量接種發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)測定菌體干重，選取最佳接種量。</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1固體培養(yǎng)

19、基試驗(yàn)的對比</p><p>　　接種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)15天，記錄生長情況如下表1，依表可知PDA( 葡萄糖)是適合菌絲生長的固體培養(yǎng)基。</p><p>　　表1不同固體培養(yǎng)基的比較（26℃）</p><p>　　2.2發(fā)酵瓶培養(yǎng)基碳氮源組合試驗(yàn)</p><p>　　下表2是發(fā)酵瓶培養(yǎng)后得到的碳氮源試驗(yàn)結(jié)果，其中序號為1，2，3，5，8的培養(yǎng)

20、基最終的發(fā)酵液夾雜玉米粉或黃豆餅粉殘?jiān)?，很難過濾，因此其干重不是純菌絲體，而2號培養(yǎng)基最終干重雖然是最多的，但由于含有玉米粉和黃豆餅粉殘?jiān)?，菌絲球明顯沒有6號培養(yǎng)基多，所以沒有將2號培養(yǎng)基定為最佳。結(jié)合菌絲鏡檢結(jié)果（見圖1、圖2），選擇6號組合為最佳碳、氮源組合。從結(jié)果看對于碳源，葡萄糖和蔗糖比較，葡萄糖利于樺褐孔菌液體菌絲的生長。對于氮源，玉米漿和黃豆餅粉比麩皮更利于樺褐孔菌液體菌絲的生長，本試驗(yàn)結(jié)果與杏鮑菇培養(yǎng)基不同，麩皮利于杏鮑菇

21、菌絲的生長[4]，但對樺褐孔菌菌絲液體培養(yǎng)的影響不明顯。確定最佳碳源：葡萄糖；最佳氮源：玉米漿。</p><p>　　表2 發(fā)酵瓶培養(yǎng)基不同碳氮源的比較（28℃，100rpm, 20天）</p><p>　　圖1（2號培養(yǎng)基） 圖2（6號培養(yǎng)基）</p><p>　　2.3發(fā)酵瓶培養(yǎng)基碳氮比試驗(yàn)</p><p>　　

22、發(fā)酵瓶培養(yǎng)基碳氮比試驗(yàn)結(jié)果如下表3，依表可知最佳碳氮源配比：葡萄糖2.00%，玉米漿1.00%。</p><p>　　表3發(fā)酵瓶培養(yǎng)基不同碳氮源配比的比較（28℃，100rpm，20天）</p><p>　　注：蛋白胨∶酵母膏為3∶2</p><p>　　2.4接種方法的比較</p><p>　　2.4.1挖塊法與菌懸液法比較</p&g

23、t;<p>　　對挖塊法和菌懸液法對比結(jié)果如下表4所示，依表可以看出可以看出兩種接種方法均能產(chǎn)生少量菌絲球，挖塊法接種產(chǎn)生的菌絲球數(shù)量相對較少，但球體較大（見圖3）；而用菌懸液接種產(chǎn)生的菌絲球數(shù)量較多，且大小相對均勻（見圖4）。就菌絲球的數(shù)量和大小看，菌懸液接種更適合菌絲生長。</p><p>　　表4 接種方法的比較（28℃，100rpm，20天）</p><p>　　圖3

24、（挖塊法） 圖4（懸液法）</p><p>　　2.4.2菌懸液接種與菌絲球接種的比較</p><p>　　將經(jīng)平板培養(yǎng)好的菌種加生理鹽水打碎后制成菌懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，待培養(yǎng)成大小均勻的菌絲球后，將菌絲球按不同數(shù)量接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)（菌絲球法），同時以菌懸液接種培養(yǎng)進(jìn)行比較，由實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種菌絲球多少對最終菌絲量影響較?。ㄒ姳?），但是接入的菌絲

25、球會在發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)形成較大的菌絲團(tuán)，容易造成菌團(tuán)中心缺氧[5]。用菌懸液直接接入發(fā)酵培養(yǎng)基形成的菌絲球小而均勻，且得到的菌體較多，因此，菌懸液接種更適合發(fā)酵瓶中菌絲生長。</p><p>　　表5 菌絲球接種方法的比較（28℃，100rpm，20天）</p><p>　　2.5 接種量的比較 </p><p>　　用菌懸液法從0.5~4.0ml進(jìn)行了梯度接種量試驗(yàn)，

26、結(jié)果如下表6所示，依表可得出最佳接種量：一半平皿菌絲加60mL生理鹽水制菌懸液，接種2.0mL/100mL培養(yǎng)基（見圖5、圖6）。</p><p>　　表6 接種量對菌絲干重的影響（28℃，100rpm，20天）</p><p>　　圖5（接種量1ml/100mL） 圖6（接種量2ml/100mL）</p><p><b>　　3結(jié)論<

27、;/b></p><p>　　3.1 利用發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)樺褐孔菌切實(shí)可行。</p><p>　　3.2 樺褐孔菌固體培養(yǎng)周期為15天，PDA為最適固體培養(yǎng)基。</p><p>　　3.3 發(fā)酵培養(yǎng)樺褐孔菌的培養(yǎng)基最佳碳氮配比為2%葡萄糖和1%玉米漿。</p><p>　　3.4 通過對不同接種方法的比較，采用菌懸液接種更為適宜，其最佳接種

28、量為2%。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 黃年來. 俄羅斯神秘的民間藥用真菌——樺褐孔菌[J]. 中國食用菌，2002, 21（4）：7-8</p><p>　　[2] 趙芬琴，樸惠善. 樺褐孔菌的研究進(jìn)展[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12（2）：96-97</p><

29、p>　　[3] 江玉姬，呂華珍，謝寶貴. 樺褐孔菌的培養(yǎng)特性研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004,19（2）：92-95</p><p>　　[4] 劉炳明，曹德賓，于迎春，等. 杏鮑菇液體培養(yǎng)條件的研究[J]. 中國食用菌，2004（1）：40-41</p><p>　　[5] 陳艷秋，李玉，周麗潔. 樺褐孔菌菌絲液體培養(yǎng)條件的研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006,28（4）：