腺病毒表達(dá)系統(tǒng)

1、腺病毒表達(dá)系統(tǒng),質(zhì)粒型表達(dá)載體,病毒型表達(dá)載體,真核生物細(xì)胞常用的表達(dá)載體,,,腺病毒表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體,,病毒表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn),高轉(zhuǎn)染效率高蛋白表達(dá)水平對轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞進(jìn)行高效轉(zhuǎn)染 (原代細(xì)胞等)穩(wěn)定,可遺傳的表達(dá) (逆轉(zhuǎn)錄病毒)可控制拷貝數(shù),如何選擇合適的病毒表達(dá)載體？,可適用的宿主細(xì)胞類型選擇標(biāo)記插入片段的大小調(diào)控元件報(bào)告基因,病毒表達(dá)載體的用途,基因治療1990年French等

2、把腺嘌呤脫氨酶基因?qū)氲揭幻?歲小女孩的T淋巴細(xì)胞中治療了腺嘌呤脫氨酶基因缺失病,開創(chuàng)了人類利用人體基因治療疾病的先例。1992年復(fù)旦大學(xué)薛京倫等首次把人凝血因子Ⅸ基因成功用于治療血友病。2005年第一個(gè)批準(zhǔn)上市的基因治療制品Adv-P53在中國上市。病毒載體疫苗,重組腺病毒的作用,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，AdV已被成功應(yīng)用于表達(dá)各種病毒和細(xì)胞的基因，腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)出蛋白的生物化學(xué)特性，可用于商業(yè)價(jià)值的開發(fā)，它可用來生產(chǎn)亞單位疫

3、苗，和新型診斷試劑盒的開發(fā)。AdV可以通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞來表達(dá)蛋白，除基因治療的相關(guān)實(shí)驗(yàn)外還可用做體內(nèi)特性研究。,被注射Ad5.CMV-LacZ的大鼠脊髓,純化腺病毒的電子顯微照片,被注射Ad5.CMV-GFP的大鼠紋狀體的切片,用AdV轉(zhuǎn)染基因的優(yōu)點(diǎn),速度快，簡單，不需要任何特殊的裝備。相對其它方法，它非常容易被接受。事實(shí)上，這種感染后細(xì)胞生存率幾乎為100%。因此，AdV有向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)而忽視毒性作用的能力。許多細(xì)胞類型均可被

4、轉(zhuǎn)染。感染后的數(shù)小時(shí)，基因表達(dá)便可被分析。刺激后，可有一種以上的基因被同時(shí)表達(dá)。,腺病毒顆粒比較穩(wěn)定,病毒基因組較少發(fā)生重排。插入外源基因的病毒基因組在連續(xù)傳代中一般保持不變。腺病毒基因組較易操作。制備大量的腺病毒較為容易?？筛腥痉至鸭?xì)胞和非分裂細(xì)胞。rAds可轉(zhuǎn)導(dǎo)肺細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、血管、肌肉、腦、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。,重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng),重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng),通過對本體蛋白的同樣的翻譯后的修飾，在細(xì)胞中表達(dá)真核蛋白。 一系

5、列腺病毒轉(zhuǎn)換因素允許產(chǎn)生高水平的異種蛋白。重組蛋白代表了整個(gè)細(xì)胞蛋白的最豐富的多肽（20%-30%）。在較好的條件下，表達(dá)系統(tǒng)在數(shù)升的293細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中可以按比例地增加，產(chǎn)量可達(dá)90mg/L。,腺病毒表達(dá)系統(tǒng),腺病毒屬于無包膜病毒,外殼由240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體構(gòu)成二十面體結(jié)構(gòu),內(nèi)部有約36kb的線性雙鏈基因組,屬于DNA病毒。外殼的五鄰體分別位于二十面體結(jié)構(gòu)的頂角、均有一個(gè)纖突蛋白(fiber)突起與其相連,腺病毒的組織親合

6、性與纖維蛋白頭部密切相關(guān)。,腺病毒的特性,腺病毒基因組編碼數(shù)十個(gè)腺病毒的結(jié)構(gòu)和功能蛋白,分為早期表達(dá)和晚期表達(dá)。早期表達(dá)的蛋白是功能蛋白、晚期表達(dá)的有功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白,并且早期的功能蛋白調(diào)控晚期蛋白的表達(dá)。早期表達(dá)的Ｅ1區(qū)蛋白(甚至包括Ｅ2區(qū)蛋白)是腺病毒基因組復(fù)制、病毒包裝和其他蛋白表達(dá)翻譯所必需的,但其對細(xì)胞的毒性也是很強(qiáng)的。E2蛋白涉及AdDNA復(fù)制, E3蛋白對抗宿主的抗病毒防御系統(tǒng), E4調(diào)節(jié)有效的晚期基因轉(zhuǎn)錄。,腺病毒的基

7、因及其功能,腺病毒感染細(xì)胞的第一步是通過纖突蛋白與細(xì)胞表面柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)結(jié)合。腺病毒粘附后,五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天門冬氨酸（ＲＧＤ)與細(xì)胞表面的整合素αｖβ3和αｖβ5結(jié)合并相互作用使病毒進(jìn)入細(xì)胞。,病毒的受體與入侵細(xì)胞的過程,第一代腺病毒載體中,Ｅ1、Ｅ3基因表達(dá)盒已經(jīng)去除了,這樣可以插入長約8kb的外源DNA。去除Ｅ1區(qū)還有一個(gè)優(yōu)勢,就是阻止了依賴Ｅ1區(qū)和Ｅ2區(qū)功能蛋白的轉(zhuǎn)錄和隨后病毒DNA的復(fù)制及病毒

8、外殼蛋白的產(chǎn)生。Ｅ1區(qū)缺失的腺病毒可以在能夠反式提供Ｅ1區(qū)基因蛋白的293細(xì)胞中得到增殖。,第一代腺病毒載體,,腺病毒基因組結(jié)構(gòu)與載體改造,HEK 293 cells have been engineered to include Adenovirus E1a/E1b genesE1a/E1b genes (integrated into 293 genome) allow replication and transcriptio

9、n of Adenovirus,構(gòu)建重組腺病毒,構(gòu)建重組腺病毒的傳統(tǒng)方法是以同源重組為基礎(chǔ)的。其一用修飾的腺病毒DNA與穿梭載體在HEK 293細(xì)胞中進(jìn)行同源重組；通過Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入loxP位點(diǎn)，然后將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre重組酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過Cre介導(dǎo)兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細(xì)胞內(nèi)同源效率高30倍。 更為流行的方法采

10、用了穿梭載體與腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一種特殊的菌株(BJ 5183)。然后從細(xì)菌中收集重組腺病毒，用其感染HEK 293細(xì)胞。,Adeno-X? Expression System,,Adeno-X? Expression System,構(gòu)建重組腺病毒不同方法比較,Ad5腺病毒可感染的寄主,人體各類組織的細(xì)胞，除造血細(xì)胞外多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞：,Plate 293 cells@ 5x105/well,,Infect cells w/ vi

11、rus dilutions,Hexon proteinsexpressed,,Fix,,Add primaryanti-hexon Ab,,Add HRP conj.secondary,,Develop,Count,Adeno-XTM Rapid Titration Kit,簡單的免疫染色方法整個(gè)過程只需48小時(shí). 而傳統(tǒng)繁瑣的方法需要2個(gè)星期才能完成對所有重組的Ad5病毒能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確而快速的滴度測定,Adeno-XTM Ra

12、pid Titration Kit 的特點(diǎn),Adeno-XTM Rapid Adenoviral purification System,第二代腺病毒載體是病毒基因組的E2A區(qū)缺失,并突變或缺失E4區(qū)基因。這種載體裝載容量有所增加(可達(dá)11kb) ,細(xì)胞毒性和免疫原性有所減弱,而目的基因的表達(dá)時(shí)間更長。,第二代腺病毒載體,一種研究方向：改造腺病毒囊膜表面五鄰體纖維蛋白的結(jié)構(gòu)。根據(jù)Adv5纖突蛋白結(jié)節(jié)區(qū)的結(jié)構(gòu)特征,去除病毒與受體(CAR

13、,柯薩奇2腺病毒受體)的親和性,經(jīng)特異性細(xì)胞結(jié)合分子模擬腺病毒纖突衣殼蛋白,使載體選擇性靶向相應(yīng)細(xì)胞,減少載體的非特異性感染及免疫反應(yīng)。,提高腺病毒載體的靶向特異性,另一種改造策略：改造腺病毒的基因結(jié)構(gòu),置換上針對癌細(xì)胞的特異型啟動(dòng)子。如裝上AFP啟動(dòng)子,使載體特異性感染肝癌細(xì)胞。,提高腺病毒載體的靶向特異性,宿主的免疫反應(yīng)仍然是獲得轉(zhuǎn)基因長期表達(dá)和重復(fù)使用腺病毒載體的主要障礙。大量研究已證實(shí),具有感染性的腺病毒載體本身就足以引起免疫

14、反應(yīng)。 更為“復(fù)雜”的腺病毒載體就是第三代腺病毒載體,在其構(gòu)建時(shí)去除了某些病毒基因,甚至是去除了全部的病毒基因。所謂的“空殼”載體起先只保留了ＩＴＲ和包裝信號,且在產(chǎn)生中需要輔助病毒和合適的互補(bǔ)包裝細(xì)胞,更需要進(jìn)一步的純化。,第三代腺病毒載體,第三代新型重組腺病毒載體刪除病毒基因中所有開放閱讀框,僅含有必要的順式元件(即ITR和鄰近的包裝信號序列) ,需要在輔助病毒存在情況下,在包裝細(xì)胞中繁殖,其安全性很高。第三代腺病毒載體不但

15、可容納較大的外源基因(32kb) ,而且較容易獲得高滴度( 109pfu /ml) 。,第三代新型重組腺病毒載體,,腺病毒在寄主細(xì)胞中呈游離態(tài)，基因瞬時(shí)表達(dá)可侵染處于分裂期或非分裂期的寄主細(xì)胞高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)雙載體系統(tǒng)的操作病毒的效價(jià)可達(dá) 1012 pfu/ml平均可插入8kb的外源片段,長期、穩(wěn)定的基因表達(dá)，可以遺傳只能侵染分裂期的寄主細(xì)胞中度的蛋白表達(dá)水平單一載體操作病毒效價(jià)達(dá) 106 pfu/ml平均可插

16、入6.5kb的外源片段,腺病毒表達(dá)系統(tǒng),逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng),Adeno-X? VS Retrovirus Expression System,,Retroviral Expression System逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng),,Env、pol、gag為RNA病毒中控制復(fù)制和表達(dá)外膜蛋白的基因。重新構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒載體將去除gag、pol、env基因，并將它們整合到包裝細(xì)胞株的基因組中。?+是RNA病毒包裝時(shí)的識別序列，保留在反轉(zhuǎn)錄病毒

17、載體中。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和改造,逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝過程,,,Retro-X Retroviral Expression Vectors,LRCX Retroviral Expression Vectors,,,,MSCV Retroviral Expression System,小鼠干細(xì)胞病毒表達(dá)載體,造血細(xì)胞胚胎干細(xì)胞胚胎性癌細(xì)胞,Pantropic Retroviral Expression System,宿主范圍廣,,

18、泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng),為什么泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍如此廣？,外膜蛋白識別宿主細(xì)胞表面的受體VSV-G外膜蛋白不需識別宿主細(xì)胞表面的受體Package cell line GP2-293整合有g(shù)ag-pol 基因pVSV-G 載體與pLXRN 載體共轉(zhuǎn)化,Pantropic Retroviral Expression Vector泛嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,帶GFP報(bào)告基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,RevTet-On & Of

19、f? Gene Expression System,,,,tetR： Tc抑制因子VP16：轉(zhuǎn)錄激活亞基tTA： Tc應(yīng)答轉(zhuǎn)錄激活因子 ：四環(huán)素或Dox,tTA,tTA,,RevTet-Off? Gene Expression System,pTet Off,pTRE2,,,RevTet-On? Gene Expression System,,,,,rtetR： 反Tc抑制因子VP16：轉(zhuǎn)錄激活亞基rtTA：

20、反Tc調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子 ： Dox,,rtTA,rtTA,pTRE2,pTet On,RevTet-Off & On? Gene Expression System,在各種細(xì)胞系中建立可調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)Tc 或 Dox 誘導(dǎo)所需的劑量遠(yuǎn)小于細(xì)胞毒素的水平，不會(huì)影響細(xì)胞的生長。外源基因表達(dá)為激活方式，容易控制。表達(dá)水平相比其他組成型的真核強(qiáng)啟動(dòng)子要高幾十倍?；虮磉_(dá)受到嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控，可以表達(dá)毒性基因等,謝