體外抗菌實(shí)驗(yàn)

1、,第二十章 藥物的體外抗菌試驗(yàn),藥物的體外抗菌試驗(yàn) 藥物的體外抗菌試驗(yàn)是在體外測(cè)定微生物對(duì)藥物敏感程度的試驗(yàn)， 已廣泛地應(yīng)用于科研、生產(chǎn)和臨床。如抗菌藥物的篩選、提取過(guò)程中的追蹤、抗菌譜的定、藥物含量的測(cè)定、藥物血濃度測(cè)定、指導(dǎo)臨床用藥的藥敏試驗(yàn)等?？咕囼?yàn)包括抑蔭試驗(yàn)和殺菌試驗(yàn)。抑菌：即抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，但不能殺死微 生物，在藥物除去后微生物又能生長(zhǎng).殺菌：即

2、能殺死微 生物，當(dāng)藥物除去后，微生 物也不能再生長(zhǎng)繁殖。,,第一節(jié) 常用的體外抑菌試驗(yàn),連續(xù)稀釋法： 可用于測(cè)定藥物的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)?？梢杂靡后w培養(yǎng)基，也可用固體培養(yǎng)基。,1．液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 2．固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 分平板法和斜面 法。,,瓊脂擴(kuò)散法： 是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴(kuò)散，在藥物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，

3、以抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來(lái)評(píng)價(jià)藥物抗菌作用強(qiáng)弱。,1、濾紙片法 適用于新藥的初篩試驗(yàn)。2．打孔法 適于藥物血濃度的監(jiān)測(cè)。3．挖溝法 適用于在一個(gè)平板上試驗(yàn)一種藥物對(duì)幾種試驗(yàn)菌的抗菌作用。,,第二節(jié) 殺菌試驗(yàn)用以評(píng)價(jià)藥物對(duì)微生物的致死活性。最低殺菌濃度： 指該藥物能殺死細(xì)菌的最低濃度。從對(duì)微生物廣義而言，也可稱(chēng)之為最低致死濃度(MLC)。,是將待檢藥物先以合適

4、的液體培養(yǎng)基在試管內(nèi)進(jìn)行連續(xù)稀釋?zhuān)抗軆?nèi)再加入一定量的試驗(yàn)菌液，培養(yǎng)后可得該藥物的MIC，取MIC終點(diǎn)以上未長(zhǎng)菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無(wú)菌平板上，培養(yǎng)后凡平板上無(wú)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度即為該藥物的MBC(或MLC)。,,,活菌計(jì)數(shù)法 是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗(yàn)菌，作用一定時(shí)間后，取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，從存活的微生物數(shù)計(jì)算出藥物對(duì)微生物的致死率。石炭酸系數(shù)（又稱(chēng)酚系數(shù)） 是以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，在規(guī)

5、定的試驗(yàn)條件下，作用一定時(shí)間，將待測(cè)的化學(xué)消毒劑與石炭酸對(duì)傷寒沙門(mén)菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較， 所得殺菌效力的比值。,,棋盤(pán)格法 是由于在試驗(yàn)時(shí)，含兩種不同濃度藥物的試管排列呈棋盤(pán)狀而得名， 用以評(píng)價(jià)兩種藥物同時(shí)用不同濃度進(jìn)行聯(lián)合試驗(yàn)時(shí)的抗菌活性。,,第三節(jié) 聯(lián)合抗菌試驗(yàn),在藥學(xué)上作中，常需檢查兩種抗菌藥物在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的相互作用以及抗菌藥物與不同pH值或不同離子溶液的相互影響。如加強(qiáng)藥物抗菌作用的為協(xié)

6、同(synergism)；減弱藥物作用的為拮抗(antagonism)；相互無(wú)影響的為無(wú)關(guān)(indjfference)；作用為二者之和的為累加(addition)。,,紙條試驗(yàn) 即在已接種試驗(yàn)菌的平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強(qiáng)、減弱或無(wú)影響來(lái)判斷它們?cè)诼?lián)合應(yīng)用時(shí)的效應(yīng)。,梯度平板紙條試驗(yàn) 需先制備含藥的梯度平板。將試驗(yàn)菌懸液涂布于平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯

7、度平板中藥物濃度遞減的方向置于平板表面。培養(yǎng)后，如該待檢藥液對(duì)平板內(nèi)的藥物有加強(qiáng)作用，則可見(jiàn)沿紙條兩邊的抑菌區(qū)被擴(kuò)大。,,第四節(jié) 體外抗菌試驗(yàn)的影響因素,1．試驗(yàn)菌 在抗菌試驗(yàn)中所用試驗(yàn)菌一般應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)菌株。2．培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的質(zhì)量須加控制。3．抗菌藥物 藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗(yàn)的結(jié)果，需要精確配制。,,第二十一章藥物制劑的微生物學(xué)檢查,,藥物制劑的微生物學(xué)檢查,藥物制劑的微生物

8、學(xué)檢查主要包括無(wú)菌檢驗(yàn)，細(xì)菌總數(shù)測(cè)定，霉菌總數(shù)測(cè)定，以及病原菌的檢驗(yàn)與螨的檢測(cè)等。,,第一節(jié) 無(wú)菌制劑的無(wú)菌檢查,（一）一般藥品的無(wú)菌檢查 一般藥品的無(wú)菌檢查法屬于直接接種法，即將檢品按規(guī)定量直接分別接種于適宜需氧菌、厭氧菌和真菌生長(zhǎng)繁殖的一定量的培養(yǎng)基中，同時(shí)以同樣的培養(yǎng)基作陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。,我國(guó)藥典規(guī)定以金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003、生袍梭狀芽胞桿菌CMCC(B)64941、白假絲

9、酵母菌CMCC(F)98001作為需氧菌、厭氧菌和真菌的陽(yáng)性對(duì)照菌株。,,（二）特殊藥品的無(wú)菌檢查法 如果陽(yáng)性對(duì)照管不長(zhǎng)菌，則必須進(jìn)行特殊處理后方可按照一般藥品的無(wú)菌檢查法進(jìn)行。,1．油類(lèi)藥物的無(wú)菌檢查 一般油劑因與常規(guī)培養(yǎng)基不混溶，藥品中的微生物不易生長(zhǎng)，所以一般可采用吐溫培養(yǎng)基，其余同一般藥品無(wú)菌檢查法。,,2．抗菌藥物或含防腐劑藥物的無(wú)菌檢查 如果被檢藥品具

10、有抗菌作用，陽(yáng)性對(duì)照管及試驗(yàn)管均可能不長(zhǎng)菌。因此在進(jìn)行無(wú)菌檢查前必須采用一些方法除去藥物本身的抗菌作用，然后再依上述方法進(jìn)行無(wú)菌檢查。,(1)加入滅活劑(2)微孔濾膜法(3)稀釋法(4)離心沉淀法,,第二節(jié) 口服藥及外用藥物的微生物學(xué)檢查,目前對(duì)口服藥及外用藥物的微生物學(xué)檢驗(yàn)主要是微生物限量檢驗(yàn)，即限制口服藥及外用藥的微生物總數(shù)和限制病原微生物種類(lèi)的系列測(cè)定項(xiàng)目。,,我國(guó)規(guī)定的項(xiàng)目有： 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定，霉菌總數(shù)測(cè)定。

11、病原菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門(mén)菌和破傷風(fēng)梭菌)的檢驗(yàn)和活螨的檢驗(yàn)等。判斷合格與否的標(biāo)準(zhǔn)是： 口服藥及外用藥中微生物總量須低于規(guī)定限量外，并須在口服藥物每克或每毫升中不得含有大腸埃希菌、沙門(mén)菌；外用藥物每克或每毫升中不得含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和破傷風(fēng)梭菌，此外均不得檢出活螨。,,,細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定: 是了解被檢藥品在單位重量或體積(每克或每毫升)內(nèi)所含有的活菌數(shù)(實(shí)際是

12、需氧菌的活菌數(shù))，以判斷供試藥物被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)該藥品整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程的衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的一個(gè)重要依據(jù)。,,,霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定： 是考察供試藥物中每克或每毫升所含的活霉菌和酵母菌的總數(shù)，以判明檢品被真菌污染的程度。,,,病原菌檢驗(yàn)的原則： 病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征的觀察是鑒別的基本要求，對(duì)生化反應(yīng)、血清學(xué)反應(yīng)、動(dòng)物毒力試驗(yàn)等項(xiàng)目的要求因菌而異，各有其側(cè)重點(diǎn)。,一般的檢測(cè)程序?yàn)椋核幬锏臏?zhǔn)備或預(yù)處理→

13、增菌培養(yǎng)→分離培養(yǎng)→純培養(yǎng)→染色鏡檢、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)等→結(jié)果判斷。,,,凡由檢品中檢出大腸埃希菌時(shí)，表明該藥品可能被糞便污染，患者服用后，有被糞便中可能存在的其他腸道致病菌和寄生蟲(chóng)卵等病原體感染的危險(xiǎn)。因此，口服藥品中不得檢出大腸埃希菌。檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小無(wú)芽胞桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在伊紅美蘭（EMB)培養(yǎng)基上分解乳 糖，產(chǎn)生紫黑色、有金屬光澤的菌落。 (3)生化反應(yīng)：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：產(chǎn)酸產(chǎn)氣

14、或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；IMViC試驗(yàn)：++--，注意與產(chǎn)氣桿菌相區(qū)別。,1、大腸埃希菌,,,檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陰性短小桿菌。(2)分離培養(yǎng)：SS瓊脂上，沙門(mén)菌不分解乳糖，產(chǎn)生H2S，菌落無(wú)色、透明或半透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，菌落中心呈黑褐色。EMB平板上菌落呈無(wú)色或粉紅色。二糖鐵培養(yǎng)基TSl上分解葡萄糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖、蔗糖，有動(dòng)力、產(chǎn)生黑色沉淀。(3)生化反應(yīng)：見(jiàn)表21—l。(4)血清學(xué)反應(yīng)：用可疑菌作為抗原

15、，沙門(mén)菌A—F組的多價(jià)血清作為抗體進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)，并以生理鹽水做對(duì)照試驗(yàn)。,2、沙門(mén)菌,,,3、銅綠假單胞菌檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陰性短桿菌。(2)分離培養(yǎng)：在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上菌落扁平，無(wú)定形，濕潤(rùn)，周邊擴(kuò)散或略有蔓延，灰白色，培養(yǎng)基上擴(kuò)散有水溶性綠色色素。(3)生化反應(yīng)：氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，可報(bào)告檢出銅綠假單胞菌。如綠膿菌素陰性，必須明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性，才

16、可報(bào)告被檢品檢出銅綠假單胞菌。,,,4、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陽(yáng)性球菌，葡萄狀排列。(2)分離培養(yǎng)及生化試驗(yàn)：見(jiàn)表21-3如分離培養(yǎng)的可疑菌甘露醇和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，則可判斷為檢出金黃色葡萄球菌。,,,5、破傷風(fēng)梭菌 檢驗(yàn)要點(diǎn)：(1)形態(tài)：革蘭陽(yáng)性芽胞梭菌，菌體細(xì)長(zhǎng)，帶芽胞的菌體呈鼓楷狀。有周鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，不形成英膜。(2)分離培養(yǎng)：葡萄糖疤肉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，消化肉渣，使肉渣變黑，有特殊臭味。新霉

17、素葡萄糖血平板上菌落蔓延生長(zhǎng)，霧狀、細(xì)絲狀或羽毛狀，邊緣不整齊，常有β溶血環(huán)。(3)毒力試驗(yàn)：白鼠皮下注射菌液，6~48小時(shí)觀察發(fā)病情況。出現(xiàn)典型的破傷風(fēng)病癥的，判定為陽(yáng)性。,,,螨：是一種小形的節(jié)肢動(dòng)物，可污染藥物制劑，使之變質(zhì)失效，并可直接危害人體健康，傳染疾病，引起皮炎、過(guò)敏性疾患或消化道、泌尿道和呼吸道疾病。因此，口服藥及外用藥中均不得檢出活螨?；铗臋z查方法一般有： 直檢法、漂浮法和分離法三種，最后都在顯