J-HNP-1多肽的重組及體外抗菌作用初步研究.pdf

1、條件致病菌感染病原菌多為耐藥菌，其主要來源于呼吸道、腸道、生殖道等粘膜表面，其感染常見于嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、移植術(shù)后、成人免疫缺陷綜合征等重癥患者。目前尚無良好的預(yù)防手段。粘膜上皮細(xì)胞有一個共同特點，即在細(xì)胞膜上具備多聚IgA受體(pIgR)。連有J鏈的IgA分子通過J鏈與pIgR結(jié)合后，將IgA分子轉(zhuǎn)運入粘膜細(xì)胞內(nèi)。本研究擬將防御素改建為一種殺菌分子，分子的一端為J鏈，另一端為防御素，稱之為多聚IgA受體(pIgR)配體樣殺菌肽。這種殺菌

2、分子因連有J鏈，具有與pIgR結(jié)合的能力。從而利用pIgR作為橋梁，將防御素轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)的微生物感染處發(fā)揮殺菌作用。本研究將HNP-1(屬α-防御素)與J鏈cDNA連接，然后在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中表達，并初步檢測其產(chǎn)物體外抗菌活性，為進一步研究其細(xì)胞內(nèi)殺菌功能提供依據(jù)。 方法：應(yīng)用PCR技術(shù)從不同的質(zhì)粒中獲得J鏈基因和HNP-1基因，然后應(yīng)用重組PCR技術(shù)將這兩個不同的基因連接在一起而成為J-HNP-1基因。將此基因克隆入哺乳動物

3、細(xì)胞表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將此重組子導(dǎo)入COS-7細(xì)胞，分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平采用RT-PCR和Westernblot分析J-HNP-1的表達情況，并體外檢測細(xì)胞可溶性蛋白及培養(yǎng)上清的抗菌活性。 結(jié)果：1.利用重組PCR技術(shù)使J鏈與HNP-1這兩個不同的基因相連接而成為J-HNP-1重組體。 2.將J-HNP-1重組體克隆入哺乳動物表達載體pcDNA3.1(-)/Myc-H

4、isC質(zhì)粒中，雙重標(biāo)簽基因Myc和6×His位于下游，6×His起著檢測標(biāo)志的作用，使J-HNP-1的表達產(chǎn)物易于檢測。 3.將重組質(zhì)粒rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1應(yīng)用正、反方向引物測序，檢測J-HNP-1的DNA序列及鑒定插入正反方向，獲得正向插入重組子。 4.RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1的COS-7細(xì)胞mRNA提取物中擴增出一條約78

5、6bp的片斷，其大小與預(yù)測相符合。采用WesternBlot印跡法，用抗His抗體檢測到轉(zhuǎn)染rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1的COS-7細(xì)胞的細(xì)胞可溶性蛋白及細(xì)胞培養(yǎng)上清(即細(xì)胞外泌蛋白)在約24KD處有一強反應(yīng)條帶出現(xiàn)。 5.初步檢測轉(zhuǎn)染rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-136h后COS-7細(xì)胞的細(xì)胞可溶性蛋白及細(xì)胞培養(yǎng)上清(即細(xì)胞外泌蛋白)抑菌作用明顯。 結(jié)論：本研究重