酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)－乙肝兩對(duì)半測(cè)定

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) －乙肝兩對(duì)半測(cè)定,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)原理,將抗原(或抗體)結(jié)合到固相載體上，當(dāng)加入陽性標(biāo)本后，相應(yīng)抗體(或抗原)結(jié)合到固相抗原(或抗體)上，利用酶標(biāo)記的抗抗體(或抗體)可檢測(cè)出標(biāo)本中與固相抗原(或抗體)結(jié)合的抗體(或抗原)。間接法、夾心法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法,乙型肝炎病毒,嗜肝病毒科－雙鏈DNA病毒三種病毒顆粒 小球型：由HBsAg組成，不含核酸管型：由小球型連接

2、而成大球型(Dane顆粒)：完整，有感染性,乙肝病毒血清標(biāo)志物,HBsAg第一個(gè)出現(xiàn)，感染后1-2周即可陽性陽性表示存在HBV感染HBsAb出現(xiàn)在HBsAg消失后保護(hù)性抗體疫苗免疫成功的標(biāo)志,乙肝病毒血清標(biāo)志物,HBeAg病毒復(fù)制標(biāo)志傳染性強(qiáng)HBeAb 傳染性降低長(zhǎng)期存在是DNA與肝細(xì)胞整合的結(jié)果,乙肝病毒血清標(biāo)志物,HBcAg HBV復(fù)制的標(biāo)志血清中檢測(cè)不出來IgM-HBcAb 急性HBV感染IgG

3、-HBcAb急性感染恢復(fù)期和慢性持續(xù)感染,乙肝病毒血清標(biāo)志物檢測(cè)原理,,試劑盒組成,包被板HBsAg－紅色HBsAb－綠色HBeAg－藍(lán)色HBeAb－粉紅色HBcAb－橘黃色,試劑盒組成,陰性對(duì)照和陽性對(duì)照酶標(biāo)記物(HBeAb測(cè)定試劑中含中和抗原)底物A和底物B終止液洗滌濃縮液,操作步驟,平衡：將試劑盒各組分從盒中取出，平衡至室溫(18-25℃ )。配洗滌液：充分搖勻濃縮洗滌液(如有晶體應(yīng)充分溶解)，用蒸餾水或去離

4、子水按1:19稀釋。編號(hào)：將微孔條固定于支架，按序編號(hào)。,操作步驟,加樣：分別用加樣器在孔中加入陰、陽性對(duì)照或待測(cè)血清樣本50ul (HBcAb測(cè)定時(shí)待測(cè)血清用生理鹽水1:30稀釋－50ul血清+1.5ml生理鹽水)。加酶：分別在每孔中加入酶標(biāo)記抗體50ul (HBeAb測(cè)定時(shí)還要在每孔中加入中和抗原HBeAg50ul)，輕拍混勻。,操作步驟,溫育：置37℃溫育60分鐘，室溫平衡5分鐘。洗滌：用洗滌液充分洗滌5次，洗滌完后扣干(每

5、次洗滌保持30-60秒的浸泡時(shí)間)。顯色：每孔加底物A、B各50ul，輕拍混勻，置37℃避光15分鐘。終止：每孔加終止液50ul，混勻。觀察結(jié)果。,結(jié)果判斷,肉眼判定(見前表)酶標(biāo)儀判定：用酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)450nm或雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定各孔OD值，并根據(jù)cut-off值判定結(jié)果OD值>cut-off值為陽性O(shè)D值<cut-off值為陰性,注意事項(xiàng),濃縮洗滌液配制前充分搖勻。加樣本時(shí)要加到孔底。加試劑

6、前應(yīng)將試劑瓶翻轉(zhuǎn)數(shù)次，使液體混勻。如果滴加，滴加前應(yīng)棄去1-2滴。,注意事項(xiàng),滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確。勿將試劑滴在孔壁上。洗滌時(shí)各孔須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶殘留。洗滌時(shí)注意孔與孔之間的交叉污染。脂血，溶血可影響結(jié)果。,注意事項(xiàng),所有樣本都應(yīng)按傳染源處理。樣品顯色深淺與樣品中抗體的含量沒有一定正相關(guān)。任何一種測(cè)試都不能絕對(duì)保證樣品中沒有低濃度的抗體存在。不同品名、不同批號(hào)的試劑不可混用，以免產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。,常見模