免疫磁珠捕獲技術結合環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測鼠疫耶爾森氏菌的研究.pdf

1、鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（以下簡稱鼠疫菌）引起的一種烈性傳染病，其具有傳染性強、病死率高、傳播速度快、自然疫源性等諸多特點。人類歷史上，曾經(jīng)發(fā)生過三次鼠疫大流行，引起數(shù)以億計人死亡，給人類帶來過沉重災難。在我國，鼠疫被列為甲類傳染病。隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術的不斷發(fā)展，鼠疫疫情雖已得到有效控制，但近年來，動物間鼠疫的流行區(qū)域不斷擴大，人間鼠疫病例呈上升態(tài)勢。與此同時，鼠疫菌作為一種典型的生物戰(zhàn)劑及生物恐怖制劑，時刻威脅著人類的安全。由此可見，鼠疫

2、的監(jiān)控對人類健康安全、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定具有重要意義。
　　眾所周知，對鼠疫菌快速、有效的檢測是控制其傳染的重要手段。目前，對鼠疫菌的常規(guī)檢測主要包括細菌學檢測、免疫學檢測、分子生物學檢測等。細菌學檢測一般分四步進行——顯微鏡鏡檢、細菌培養(yǎng)、鼠疫噬菌體裂解實驗、動物實驗。該方法耗時長、需要大量人力物力，不適用于鼠疫菌大量篩查及現(xiàn)場檢測。分子生物學檢測，即通過體外擴增特異性的核酸片段實現(xiàn)對鼠疫菌的檢測，該方法雖然具有快速、靈敏、特異

3、等優(yōu)點，但其往往需要特定儀器才能進行，且價格昂貴，操作不便。因此，不適用于偏遠地區(qū)實驗室及野外檢測。免疫學方法是一種基于抗原抗體特異性反應的檢測方法，主要以膠體金、酶聯(lián)免疫吸附實驗等方法為代表。這些方法具有操作簡便、安全性高、特異性好且靈敏度高等優(yōu)點，但在檢測前一般都需要進行增菌培養(yǎng)，耗費大量時間，并且該方法抗干擾能力較差。因此，建立一種可快速、高效、適用于偏遠地區(qū)，且抗干擾能力強的檢測方法十分重要。
　　環(huán)介導恒溫核酸擴增技術（

4、loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP）是由Notomi等人于2000年報道的一種分子生物學檢測新技術。此技術針對靶基因的4—6個特異性區(qū)域，分別設計特異性引物，在一種具備鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，在恒溫條件即可實現(xiàn)對目的基因快速、高效、特異性檢測。LAMP擴增反應過程中會形成大量的、白色焦磷酸鎂（Mg2P2O7）沉淀，因此，可

5、通過肉眼或運用實時濁度儀檢測沉淀生成量的多少來判斷擴增反應進行的程度。若在反應前向反應體系中加入鈣黃綠素這種復合熒光素，則可通過肉眼直接觀察反應體系顏色是否由黃色變?yōu)榫G色來判斷反應是否發(fā)生。
　　實際檢測中，待檢樣本通常是復雜的混合物，多種雜質往往會對檢測結果產(chǎn)生干擾，難于直接進行檢測。免疫磁珠技術(immunomagnetic beads techniquces)能將靶標物與雜質分離，從而實現(xiàn)靶標物的富集。免疫磁珠技術是20世紀

6、70年代興起的一種基于免疫學原理的分離技術。此技術是一種利用具有超順磁性的磁性微球作為載體對目標物進行捕獲、富集的生物學技術。這種具有超順磁性的微球在經(jīng)過一系列活化后，并與生物基團或者生物配體有效地結合在一起才可形成免疫磁珠，實現(xiàn)對待檢物的特異性分離。
　　本研究將免疫磁珠分離技術(immunomagnetic separation,IMS)與環(huán)介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplifica

7、tion of DNA, LAMP)相結合，以LAMP特異性檢測為基礎，以磁珠捕獲DNA或免疫磁珠捕獲菌體為條件，分別建立了磁珠捕獲DNA法結合環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測鼠疫菌以及免疫磁珠捕獲菌體法結合環(huán)介導恒溫擴增技術快速檢測鼠疫菌。分別對兩種檢測方法的LAMP檢測體系、磁珠捕獲體系、免疫磁珠制備體系進行優(yōu)化，以及分別對每種方法的靈敏度、特異性、抗干擾能力、實際樣本應用等多個方面均進行了全面的評價。
　　本研究基于鼠疫菌3a保守

8、序列，設計LAMP引物，并以擴增效率、特異性為標準從設計出的多組引物中篩選出最佳引物。并以篩選出的最佳引物為基礎，對LAMP反應體系中，Bst DNA聚合酶加入量、dNTPs加入量、鎂離子濃度等反應條件進行了優(yōu)化，最終建立了25μl體積的LAMP反應體系，具體為：10×Thermopol buffer2.5μl，MgSO4(100mM)1.5μl，dNTP MIX(2.5mM)14μl，F(xiàn)IP(100mM)0.4μl，BIP(100mM

9、)0.4μl，F(xiàn)3(10mM)0.5μl，B3(10mM)0.5μl，LF(10mM)0.2μl，Bst DNAPolymerase,Large Fragment(8,000U/ml)1μl，水3μl，模板1μl。65℃反應60min。并對建立的LAMP反應體系在鼠疫菌檢測方面的靈敏度、特異性及抗干擾能力等性能進行評價。實驗結果顯示，建立的LAMP反應體系在鼠疫菌檢測方面有良好的特異性、抗干擾能力，靈敏度可達100copy/ml。

10、>　　在磁珠捕獲DNA法結合LAMP技術快速檢測鼠疫菌研究中，將LAMP技術與磁珠捕獲DNA技術相結合，依據(jù)磁珠加入量、DNA富集程度對磁珠捕獲DNA體系進行優(yōu)化，得到最佳體系。并對該檢測方法的靈敏度、特異性及抗干擾能力進行了評價，將該方法與常規(guī)PCR檢測技術進行對比。實驗結果顯示，該方法特異性良好，對鼠疫菌檢測靈敏度可達10copy/ml，較常規(guī)PCR技術靈敏度高100倍。在脾臟、肺臟干擾情況下其靈敏性依然可以達到10copy/ml，

11、比常規(guī)PCR技術高出1000倍。在肝臟懸液干擾情況下該檢測方法的靈敏度稍有降低至103copy/ml，仍然比常規(guī)PCR技術高出10倍。
　　在免疫磁珠捕獲菌體法結合LAMP技術快速檢測鼠疫菌研究中，首先，基于實驗室已有的鼠疫菌F1單克隆抗體，采用EDC/NHSS化學偶聯(lián)法將鼠疫菌抗體與磁珠相偶聯(lián)制備免疫磁珠。按實際捕獲效率、抗體偶聯(lián)率、抗體添加量、檢測中免疫磁珠用量等進行了優(yōu)化，并對該檢測方法的靈敏度、特異性、抗干擾能力等方面進行

12、了全面評價，并將該方法與常規(guī)PCR檢測技術進行對比。實驗結果顯示，該方法可特異地捕獲待檢混合物中的鼠疫菌，靈敏度為1copy/ml，較常規(guī)PCR技術靈敏度高100倍。在脾臟、肺臟干擾情況下其靈敏性為10copy/ml，其靈敏度比常規(guī)PCR技術高出1000倍。在肝臟干擾情況下靈敏性為100copy/ml，較常規(guī)PCR技術高100倍。隨后，采用滅活鼠疫菌為免疫原免疫小鼠，經(jīng)小鼠免疫、細胞融合、雜交瘤細胞篩選、細胞株克隆、腹水制備、抗體純化等

13、步驟制備出不同于F1抗體的鼠疫菌單克隆抗體，并將制備出的單抗應用于免疫磁珠捕獲菌體法結合環(huán)介導恒溫擴增技術檢測鼠疫菌。實驗結果顯示，制備出的抗體效價較高，且在檢測方法上有較好的靈敏度，可應用于鼠疫菌的快速檢測。
　　本研究建立了兩種較為成熟的鼠疫菌檢測方法，這兩種檢測方法操作簡便、無需大型儀器、成本低廉，且具有較高的靈敏性、極強的特異性、很強的抗干擾能力，所以，這兩種檢測技術適合用于現(xiàn)場篩查、野外作業(yè)及偏遠地區(qū)檢測工作的應用。

14、r>　　在現(xiàn)有免疫學檢測方法中，表達于鼠疫菌表面的F1抗原已成為唯一的靶標物，而鼠疫菌只有以37℃人工培養(yǎng)或哺乳動物體內為條件才可在表面形成F1抗原，而鼠疫菌最適生長溫度為26℃，且自然環(huán)境中溫度遠遠低于37℃，因此，自然環(huán)境下，鼠疫菌表面并不表達F1抗原。這一現(xiàn)象的存在，對現(xiàn)有鼠疫菌免疫學方法的檢測帶來諸多不便。本研究制備出的單克隆抗體對表面不表達F1抗原的鼠疫菌有良好的特異性，彌補了現(xiàn)階段免疫學檢測的漏洞，為鼠疫菌的檢測提供了更廣闊