竹節(jié)參總提物對(duì)h2o2誘導(dǎo)sh-sy5y神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

1、竹節(jié)參總提物對(duì)竹節(jié)參總提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)誘導(dǎo)SHSY5YSHSY5Y神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用損傷的保護(hù)作用楊莉，袁丁，代艷文，狄國(guó)杰，張長(zhǎng)城，劉朝奇，王婷（443002湖北宜昌，三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院）[摘要]目的觀察竹節(jié)參總提物對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的SHSY5Y人神經(jīng)瘤母瘤細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法細(xì)胞分為正常對(duì)照組，H2O2（600moLL）處理組和H2O2竹節(jié)參總提物(0.1、1、5、20gmL）預(yù)處理組。體外培養(yǎng)SHSY5Y細(xì)

2、胞，加入竹節(jié)參總提物孵育12h，再加入H2O2作用12h建立氧化損傷模型。顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，酶生化法檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）釋放量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛（MDA）含量，DCFADA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與H2O2組比較，竹節(jié)參總提物各劑量組較H2O2組的細(xì)胞存活率上升，分別上升了14.4%、29.88%、32.48%、38.98%（P0.05）；LDH釋放

3、量下降，其中5、20gmL分別下降了60.19%和57.71%(P0.05)；SOD活力顯著升高，竹節(jié)參總提物1、5、20gmL較模型組上升了66.25%、56.37%和80.94%（P0.05）；MDA含量顯著降低，竹節(jié)參總提物1、5、20gmL較模型組下降了51.52%、86.28%和87.54%（P0.01）；ROS熒光強(qiáng)度及細(xì)胞凋亡率也顯著降低。結(jié)論竹節(jié)參總提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SHSY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)增

4、強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力從而減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。[關(guān)鍵詞]竹節(jié)參總提物；H2O2；氧化應(yīng)激；凋亡[中圖法分類號(hào)][文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（81100957）；湖北省自然科學(xué)基金（2010CDB10703）；三峽大學(xué)博士啟動(dòng)基金（KJ2009B077）[通信作者]王婷，電話：（0717）6397466，Email:tingting0301@神經(jīng)退行性疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病。氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病中

5、發(fā)揮著重要作用[1]。氧化應(yīng)激是在機(jī)體受到有害刺激時(shí)，體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷引發(fā)一系列疾病[2]。竹節(jié)參是我國(guó)常見(jiàn)的中草藥，據(jù)2010版中國(guó)藥典記載，竹節(jié)參具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補(bǔ)虛強(qiáng)壯的功效。有研究表明竹節(jié)參總提物（PanaxJaponicusextractPJE）具有較好的抗氧化活性[3]及清除自由基的功效[45]。但竹節(jié)參總提物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的

6、保護(hù)作用鮮有報(bào)道，基于此本文采用體外培養(yǎng)SHSY5Y細(xì)胞，給予竹節(jié)參總提物后用H2O2刺激，觀察竹節(jié)參總提物的保護(hù)作用，為抗神經(jīng)退行性疾病藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。1材料與方法材料與方法1.11.1材料材料人神經(jīng)瘤母瘤細(xì)胞（SHSY5Y）由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。細(xì)胞以含10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。竹節(jié)參總提物：取竹節(jié)參干燥根莖粗粉，加入60%乙醇加熱回流3次，合并濾液后濃縮干燥，得到竹節(jié)參總提物

7、粉末，得率為25.8%。雙氧水（H2O2，北京化工廠生產(chǎn)）；DMEM培養(yǎng)基（Gibico公司）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Gibico公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）；活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；AnnexinⅤPI試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。熒光倒置顯微鏡（NIKONTP1020）；NU4750E

8、型CO2培養(yǎng)箱；DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)；SW4T2F潔凈工作臺(tái)；KQ500B超聲波清洗器。1.21.2方法方法1.2.11.2.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于孔板中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，分別加入不同濃度（0.1、1、5、20gmL）的竹節(jié)參總提物培養(yǎng)12h，再加入H2O2（600moLL）繼續(xù)培養(yǎng)12h。模型組直接加入600moLLH2O2處理12h。(以下實(shí)驗(yàn)細(xì)胞處理方法相同)1.2.21.

9、2.2MTTMTT法檢測(cè)細(xì)胞活力法檢測(cè)細(xì)胞活力收集細(xì)胞，制成5104mL細(xì)胞懸液，取96孔酶標(biāo)板，每孔加入200L細(xì)胞懸液，處理后各孔同時(shí)加入20LMTT（5gL），37℃孵育4h，棄上清，每孔加入150LDMSO，混勻后于酶標(biāo)儀上570nm測(cè)定光密度值。1.2.31.2.3SHSY5YSHSY5Y細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡觀察正常對(duì)照組、H2O2組、竹節(jié)參總提物各劑量組保護(hù)后的細(xì)胞形態(tài)。1.2.41.2.4酶生化法檢測(cè)

10、酶生化法檢測(cè)LDHLDH釋放量、釋放量、SODSOD活力和活力和MDAMDA含量含量收集細(xì)胞上清，參照LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清LDH的活性。裂解細(xì)胞，參照SOD、MDA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞SOD活力及MDA的含量。1.2.51.2.5細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光檢測(cè)參照活性氧檢測(cè)試劑盒進(jìn)行處理，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。1.2.61.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率消化細(xì)胞，參照度較H2O2組降低，且熒光強(qiáng)度隨著

11、總提物濃度的升高而降低。見(jiàn)圖2。2.62.6竹節(jié)參總提物對(duì)竹節(jié)參總提物對(duì)H2O2損傷的損傷的SHSY5YSHSY5Y神經(jīng)細(xì)胞凋神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響亡的影響正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為3.2%，活細(xì)胞占96.2%；H2O2組的凋亡率為53.3%，活細(xì)胞占30.2%；竹節(jié)參總提物用藥組5gmL和20gmL的凋亡率分別下降至7.8%和3.3%，活細(xì)胞上升至65.0%和83.6%。A：正常對(duì)照組；B：H2O2組；C：H2O2PJE（0.1gmL）組；D

12、：H2O2PJE（1gmL）組；E：H2OPJE（5gmL）組；F：H2O2PJE（20gmL）組圖2竹節(jié)參總提物對(duì)H2O2損傷的SHSY5Y神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響3討論討論氧化應(yīng)激是神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制之一[6]。研究表明，在神經(jīng)退行性疾病中，腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平也隨之提高，神經(jīng)細(xì)胞受到活性氧的攻擊后發(fā)生凋亡[7]。SHSY5Y細(xì)胞系是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，分化程度較低，且增殖較快，在藥理實(shí)驗(yàn)中多采用H2O2誘導(dǎo)其凋亡作為神經(jīng)退行性疾

13、病模型。本實(shí)驗(yàn)給予竹節(jié)參總提物預(yù)保護(hù)12h，然后采用H2O2作為外源性自由基生成系統(tǒng)，作用于SHSY5Y細(xì)胞12h，模擬神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激。從細(xì)胞形態(tài)上看，給予竹節(jié)參總提物預(yù)保護(hù)后，形態(tài)改變明顯減少。細(xì)胞活力顯著上升，細(xì)胞膜的完整性也有明顯的改善。自由基可以和細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)生MDA，SOD是清除氧自由基的首要物質(zhì)，也是生物體抗氧化體系的重要組成部分。本研究結(jié)果顯示，竹節(jié)參總提物能有效降低MDA含量和升高SOD活力。參與氧化應(yīng)激的

14、主要是過(guò)量的自由基，通過(guò)DCFADA探針檢測(cè)法，可以從熒光顯微鏡中直接觀察到細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量的高低，竹節(jié)參總提物可以降低由H2O2所致的細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。從而表明竹節(jié)參總提物可以有效地減弱氧化應(yīng)激損傷。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果更好地驗(yàn)證了上述觀點(diǎn)，活性氧的升高會(huì)耗竭內(nèi)源性氧化劑從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，有研究表明，阻斷ROS的產(chǎn)生，就可以阻止布西拉明（該藥物通過(guò)促關(guān)節(jié)腔滑液細(xì)胞的凋亡來(lái)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）的促凋亡作用[8]，竹節(jié)參總提物可以明顯減少細(xì)胞凋

15、亡程度，提高細(xì)胞的存活率。本研究結(jié)果充分顯示竹節(jié)參總提物對(duì)H2O2所致的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，但對(duì)其作用靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：[1]KovacicPSomanathanR.Redoxprocessesinneurodegenerativediseaseinvolvingreactiveoxygenspecies[J].CurrNeuropharmacol201210(4):289302.[2]PoljsakBSuput

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