FGF1通過干預(yù)炎癥發(fā)揮對糖尿病腎病改善作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是在糖尿病病程中出現(xiàn)的以蛋白尿、水腫、腎功能不全等腎臟病變?yōu)樘卣鞯募膊?，是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，糖尿病腎病的發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜，涉及不同種刺激因素和信號通路，其中炎癥機(jī)制是發(fā)病的一個重要因素。FGF-1是一種對來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的多種類型的細(xì)胞具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞生長因子，具有顯著的促分裂活性。已有研究報道FGF-1在降低糖尿病小鼠血糖、提高胰島素敏感性和促進(jìn)脂

2、肪組織重構(gòu)等方面具有重要的作用，F(xiàn)GF1與代謝調(diào)節(jié)之間的關(guān)系越來越受到人們的關(guān)注。本研究從炎癥的角度探索FGF1對糖尿病腎病的保護(hù)作用，并進(jìn)一步證明其抗炎作用是通過NF-κB和JNK信號通路。通過本研究，我們將對FGF-1在糖尿病腎病中的作用及其機(jī)制產(chǎn)生更進(jìn)一步認(rèn)識，同時為指導(dǎo)開發(fā)安全有效的糖尿病腎病治療藥物提供充實(shí)的理論依據(jù)。
　　方法： rhFGF1蛋白構(gòu)建和表達(dá)純化：以NdeI和HindIII為克隆位點(diǎn)，將編碼rhFGF1（

3、殘基1-155）的cDNA克隆到表達(dá)載體 pET30a中，然后將重組載體導(dǎo)入 BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞，37℃培養(yǎng)至600nm處吸光度為0.8，加入異丙基-L-硫代-β-吡喃葡萄糖苷（IPTG），使其終濃度為1mM，誘導(dǎo)4h，高體積勻漿機(jī)破碎細(xì)胞。FGF1純化首先通過肝素親和層析，然后采用大小排阻層析（Superdex-100）。12％SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度，使其純度＞98%。
　　體內(nèi)研究FGF1對糖尿病腎臟的作

4、用：①臨床抽取11名糖尿病腎病受試者和11名正常受試者血清，采用Elisa試劑盒（Human）檢測血清FGF1含量；各抽取9只Ⅰ型（STZ誘導(dǎo)）和Ⅱ型（db/db）糖尿病小鼠及其對應(yīng)同品系正常小鼠血清，采用Elisa試劑盒（Mouse）檢測血清FGF1含量。②Ⅱ型糖尿病模型：選取10周齡雄性db/db(C57BLKS/J-leprdb/leprdb)小鼠及其非糖尿病db/m同窩小鼠，每隔一天腹腔注射（IP）FGF1（0.5mg/kg），

5、連續(xù)注射8周，db/m和db/db對照組則同步注射0.9%生理鹽水作為對照；Ⅰ型糖尿病模型：C57BL/6小鼠按150mg/kg單次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），鏈脲佐菌素用0.1M檸檬酸鹽緩沖液（PH4.5)溶解。對照組小鼠注射相同體積的0.1M檸檬酸鹽緩沖液（PH4.5)。7天后，小鼠血糖≥300 mg/dl則認(rèn)為是一型糖尿病模型。將STZ誘導(dǎo)的一型糖尿病小鼠每隔一天按0.5mg/kg的劑量腹腔注射FGF1,連續(xù)注射12周，正常對照

6、組和STZ模型對照組同步注射0.9%生理鹽水；Ⅱ型和Ⅰ型糖尿病小鼠均每周測體重和血糖，處死前采用代謝籠收集24h尿量；③收集血液和腎臟組織，通過自動生化分析儀檢測血糖，總甘油三酯，血清尿素氮，血清肌酐以及尿蛋白含量，采用Western印跡，實(shí)時熒光定量PCR，透射電子顯微鏡，免疫組化，免疫熒光以及各種組織學(xué)染色檢測組織病理學(xué)改變和腎臟炎癥，以及NF-κB與JNK信號通路激活。
　　體外研究FGF1對糖尿病腎病的作用：用DMEM（低

7、糖）培養(yǎng)基（包含10%FBS，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素）培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至亞匯合時，用無血清培養(yǎng)基饑餓24h，F(xiàn)GF1(1,10,100 ng/mL)或SP600125(10μM)預(yù)處理1h，然后用25mM葡萄糖（高糖）或1μg/mL TNF-a處理2h，收集細(xì)胞進(jìn)行Western印跡、實(shí)時熒光定量PCR和細(xì)胞免疫熒光分析，檢測細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和NF-kB與JNK信號通路激活。
　　結(jié)果：Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病

8、患者和小鼠體內(nèi)FGF1含量均下降，但FGF1只能降低Ⅱ型糖尿病小鼠血糖，對STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠血糖無影響；生化指標(biāo)分析結(jié)果顯示糖尿病小鼠血清總甘油三酯，血清尿素氮，血清肌酐以及尿蛋白含量上升而給予FGF1治療后，各指標(biāo)明顯下降；同時，結(jié)果顯示，雖然FGF1對小鼠體重沒有影響，但卻顯著降低了腎臟指數(shù)[腎重(mg)/體重(g)]，而HE、PAS以及Masson染色顯示高血糖導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腎小球肥大，腎小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張以及腎纖維化，而

9、給予FGF1治療后，這些癥狀得到顯著改善；腎組織免疫組化、Western印跡以及實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF1明顯抑制了腎臟炎癥因子的生成，緩解腎臟炎癥。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果保持一致，F(xiàn)GF1能抑制高糖或TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，并且體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均顯示FGF1減弱了NF-kB的核轉(zhuǎn)入和JNK的磷酸化。
　　結(jié)論：長期腹腔注射FGF1顯著改善了Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病模型小鼠腎臟炎癥、腎小球和腎小管損傷以及腎功能障礙