MiR-326通過FGF1調(diào)控Crybb2的表達延緩晶狀體渾濁的機制研究.pdf

1、白內(nèi)障嚴重影響人類健康，是最常見的致盲原因之一。其中絕大部分是隨年齡增長所引起的老年性白內(nèi)障。目前國內(nèi)外治療老年性白內(nèi)障的方法仍集中于手術治療，缺乏有效的預防及早期治療藥物。因此，深入研究晶狀體渾濁的發(fā)生、發(fā)展機制，篩選有效的抗晶狀體渾濁藥物，尤其提倡從早期預防著手、盡力降低低齡患者的二次手術率，不僅能減輕患者痛苦，而且具有重要的社會、經(jīng)濟效益。
　　哺乳動物晶狀體中的晶體蛋白，主要分為α、β、γ三大類。此前，文獻研究大都集中在α

2、族晶體蛋白類的研究，挖掘其“伴侶蛋白”對抗晶狀體渾濁的作用。但是，進一步研究發(fā)現(xiàn)，βB2晶體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能均十分特殊，且在哺乳動物晶狀體中該蛋白成分含量最高，故其結(jié)構(gòu)及水溶性成分的水平對于維持晶狀體的透明性和折射率至關重要。如能適度調(diào)控其表達，有望成為延緩晶狀體渾濁進程的有效手段。因此，βB2晶體蛋白更加適合作為年齡相關性晶狀體功能研究的靶蛋白。為此，探尋可調(diào)控βB2晶體蛋白表達的上游microRNA，并明確其調(diào)控機制，從而實現(xiàn)調(diào)控β

3、B2晶體蛋白在晶狀體中的表達量，進而延緩晶狀體渾濁的進程。
　　MicroRNAs是一類非編碼單鏈小分子RNA，在胚胎發(fā)育、分化，細胞增殖、凋亡、代謝和適應環(huán)境壓力等進程的轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用。研究表明miRNAs在眼部組織，包括角膜、脈絡膜小疣、視網(wǎng)膜、玻璃體、晶狀體和中均有特異性表達，并可能通過調(diào)控晶體蛋白的表達，參與晶狀體混濁的發(fā)生、發(fā)展過程。因此，探究特異性調(diào)控βB2晶體蛋白表達的miRNA，對老年性白內(nèi)障的早期預防和治療

4、具有重要價值。
　　本文探討miR-326在人晶狀體上皮細胞HLEC-B3中的功能及其調(diào)控Crybb2可能的分子機制，并驗證了miR-326在硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體中的治療作用，為老年性白內(nèi)障的早期預防和治療提供了新途徑。
　　我們首先通過數(shù)據(jù)庫的篩查和文獻閱讀，篩選出miR-326、miR-204-5p、miR-491-5p、miR-330-5p四個與βB2基因相關的miRNA。之后采用實時熒光定量PCR驗證了miR-3

5、26、miR-204-5p在βB2基因敲除(KO)小鼠晶狀體中的表達量與C57BL/6野生型(WT)小鼠相比明顯下調(diào)。其中，miR-326的表達差異最顯著，提示晶狀體中miR-326水平可能與Crybb2的表達有某種相關。隨后，我們在人晶狀體上皮細胞HLEC-B3中，用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-326的下游靶基因為FGF1。進一步實驗證實:在晶狀體上皮細胞中抑制miR-326的表達可促使FGF1的表達量增加，進而上調(diào)Crybb2

6、的表達量，最終有助于抗晶狀體混濁的發(fā)生、發(fā)展。由此，初步闡明了在細胞中miR-326調(diào)控Crybb2的作用機制。此外，通過硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體中的研究也支持上述結(jié)論。
　　綜上所述，本實驗探尋出一條可以通過抑制晶狀體內(nèi)miR-326的表達，促使FGF1的表達、增加晶狀體內(nèi)βB2晶體蛋白表達量，從而有效延緩老年性白內(nèi)障的新途徑;并以此為基礎申報了國家發(fā)明專利;擬開發(fā)以miR-326為中心的新型抗晶狀體渾濁藥物，為老年性白內(nèi)障的“

7、未病先防”提供理論及實驗依據(jù)。
　　第一部分 WT與Crybb2-/-小鼠晶狀體中miRNA的篩查
　　目的:篩查與βB2具有靶向聯(lián)系，且在WT與Crybb2-/-小鼠晶狀體中表達差異較大的miRNA。
　　方法:通過小鼠基因鑒定技術，鑒定WT、Crybb2-/-小鼠;通過PicTar、SangermiRBase及TargetScan algorithms數(shù)據(jù)庫及通路分析篩選出與βB2基因之間存在靶向性關系的miRNA

8、;采用qRT-PCR驗證上述候選靶基因在WT、Crybb2-/-小鼠晶狀體中的表達差異。
　　結(jié)果:(1)挑選出四個與βB2之間存在靶向性關系的miRNA: miRNA-326、miR-204-5p、 miR-330-5p、miR-491-5p;(2)通過qRT-PCR篩查發(fā)現(xiàn)miR-326、miR-204-5p在WT、Crybb2-/-小鼠晶狀體中表達差異顯著，尤其是miR-326的表達差異更為明顯。
　　結(jié)論: miR-

9、326可能通過某種途徑調(diào)控βB2晶體蛋白的表達。
　　第二部分 MiR-326在晶狀體上皮細胞(HLEC-B3)中調(diào)控Crybb2表達的機制探究
　　目的:探討miR-326通過何種通路影響下游基因、調(diào)控Crybb2表達。
　　方法:(1)采取雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，明確miR-326的下游靶基因;在HLEC-B3細胞分別轉(zhuǎn)染miR-326 agomir（模擬物）和antagomir（抑制體）72h后，采用wester

10、n blot、免疫熒光技術檢測下游靶基因及Crybb2的表達情況;(2)在HLEC-B3細胞中分別轉(zhuǎn)染FGF1因子及shFGF1，48h后采用western blot檢測Crybb2的表達變化;(3)在HLEC-B3細胞中分別轉(zhuǎn)染FGF1因子及shFGF1，2h后兩組分別轉(zhuǎn)染miR-326antagomir，培養(yǎng)72h后采用western blot分別比較上述FGF1因子組及shFGF1組與陰性對照組中Crybb2表達的變化;(4)在H

11、LEC-B3細胞中分別轉(zhuǎn)染miR-326 agomir和antagomir48h后，采用200μM H2O2處理HLEC-B3細胞24h，誘導細胞凋亡，采用流式細胞儀觀察細胞凋亡率。
　　結(jié)果:(1)實驗證實miR-326的下游靶基因為FGF1;(2) FGF1可以有效調(diào)控晶狀體上皮細胞中Crybb2的表達;(3)證實在HLEC-B3中抑制miR-326表達后FGF1的表達量上調(diào)，最終使Crybb2高表達;反之，在HLEC-B3中

12、增加miR-326的表達量后，F(xiàn)GF1的表達量下調(diào)，最終降低Crybb2的表達;(4)在HLEC-B3中下調(diào)miR-326的表達量使FGF1表達上調(diào)，可以抑制晶狀體上皮細胞的凋亡。
　　結(jié)論:(1) miR-326通過與靶基因FGF1的3'-UTR結(jié)合而特異性抑制FGF1的表達，從而抑制Crybb2的表達;(2)在晶狀體上皮細胞中抑制miR-326的表達可以抑制其凋亡，進而與晶狀體渾濁的發(fā)生、發(fā)展相關。
　　第三部分 MiR

13、-326在硒性白內(nèi)障模型大鼠晶狀體內(nèi)調(diào)控Crybb2表達并延緩白內(nèi)障進展的探究
　　目的:探討miR-326在硒性白內(nèi)障模型鼠晶狀體內(nèi)調(diào)控Crybb2表達并延緩白內(nèi)障進展的作用。
　　方法:9天齡SD大鼠皮下注射亞硒酸鈉溶液（25μmol/kg），構(gòu)建亞硒酸鈉白內(nèi)障模型鼠;左眼為陰性對照，滴加miR-326 antagomir（抑制體）的陰性對照，右眼為治療眼，滴加miR-326抑制劑antagomir（抑制體），陰性對照與

14、治療眼，每天早晚兩次滴藥，每次100μl，每天每只眼球共用藥1nmol，觀察白內(nèi)障渾濁進展;采用qRT-PCR檢測晶狀體內(nèi)藥物作用情況，并采用western blot技術檢測晶狀體內(nèi)FGF1、Crybb2的表達變化。
　　結(jié)果:(1)硒性白內(nèi)障模型鼠眼滴miR-326 antagomir（抑制體）后，其晶狀體內(nèi)miR-326表達量下降，F(xiàn)GF1及Crybb2表達量升高。(2)滴加miR-326 antagomir（抑制體）的治療眼