2細(xì)胞培養(yǎng)及建立泡沫細(xì)胞模型

1、2)實(shí)驗(yàn)手段(1)細(xì)胞培養(yǎng)及建立泡沫細(xì)胞模型將THP1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，于370C5CO:培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。該細(xì)胞株屬人類(lèi)單核細(xì)胞系，在培養(yǎng)液中呈簇集狀懸浮生長(zhǎng)，倍增時(shí)間大約在26h后。細(xì)胞濃度控制在106mL，每?jī)商鞊Q液一次，每四天傳代一次。細(xì)胞復(fù)蘇后，傳至3=5代后方可用于建模。(2)建立巨噬細(xì)胞模型取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分為正常組和模型組，調(diào)整細(xì)胞濃度為106mL，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2mL。正常組

2、在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。模型組先置于含160nmolLPMA的RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)72h，貼壁后輕輕吸去上清液，PBS洗3遍，更換10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液，即得巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的鑒定己在發(fā)表文獻(xiàn)中完成。(3)建立巨噬源性泡沫細(xì)胞模型將獲得的巨噬細(xì)胞更換含3%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，并加入終濃度為80mgL的OxLDL，共同孵育48h，油紅。染色后，鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)充滿(mǎn)

3、橘紅色脂滴，即得泡沫細(xì)胞模型，此過(guò)程即為泡沫化。(4)針對(duì)CaSR的siRNA的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染根據(jù)公認(rèn)的siRNA設(shè)計(jì)原則(NatBiotech200422:326330)設(shè)計(jì)針對(duì)CaSR的3條siRNA，選用驗(yàn)證后效果最好的一條。同時(shí)合成陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染試劑選用Invitrogen公司生產(chǎn)的LipofectamiMRNAiMAXTransfectionReagentosiRNA目標(biāo)序列的選取原則:工從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的AUG起始

4、密碼開(kāi)始，尋找‘`AA’二連序列，并記下其3’端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。注意:GC含量在4_5070_5_5%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效在設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)_5’和3’端的非編碼區(qū)CuntranslatedregionsUTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。片，D一

5、Hanks液沖洗2遍，用1OOL的鈣離子探針Fluo3AM與F127混合工作液(10molLFluo3AM0.02070F127)滴于蓋玻片上，370C避光40minD一Hanks液再次沖洗玻片3遍，洗去多余染料，保留少許DHanks液平衡細(xì)胞10min，分組施加因素后，于10min內(nèi)利用LSCM進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度檢測(cè)。(7)油紅O染色油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三醋結(jié)合呈小脂滴狀。脂溶性染料能溶于組織和細(xì)胞中的

6、脂類(lèi)，它在脂類(lèi)中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置人染液時(shí)，染料則離開(kāi)染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，誘導(dǎo)建模結(jié)束后，吸去上清液，用PBS洗三次，冰凍的4多聚甲醛固定_5min，PBS洗一次，再置于丙二醇中固定_5min，輕輕吸去丙二醇，加入0._5%油紅O的丙二醇溶液，置60℃烤箱中染色1_5min，用8_5%丙二醇沖洗_5min，再用PBS洗三次，蒸餾水清洗1次，蘇木素復(fù)染25mi

7、n107oHCL分色及返藍(lán)后封片。置顯微鏡下觀察并攝像，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)為紅色，胞核為藍(lán)色。參考文獻(xiàn):ZhengXDLiQTangXBLiangSJChenLPZhangSWangZGGuoLZhangRZhuDL.SourceoftheelevationCa2evokedbyISHETEinpulmonaryarterialmyocytes.EuropeanJournalofPharmacology2008601:1622(8)細(xì)胞內(nèi)膽固醇

8、含量的測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇的提取:細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去上清液，冰預(yù)冷PBS洗三次，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，加1mL冰預(yù)冷0.9%生理鹽水重懸細(xì)胞，反復(fù)凍融三次，冰浴中超聲破碎_(kāi)5min，得細(xì)胞裂解液，分裝，每份200匹，700C貯存，用于測(cè)定總膽固醇和游離膽固醇?？偰懝檀嫉奶崛?取160L上述細(xì)胞裂解液，加300L15KOH乙醇溶液，_500C水解2h，加正己烷一異丙醇(4:1)SOOL渦漩30s40C下3600rmin離心