抗菌藥物敏感性試驗(yàn)及細(xì)節(jié)耐藥檢測(cè)

1、1抗菌藥物敏感性試驗(yàn)與菌藥物敏感性試驗(yàn)與細(xì)節(jié)耐藥性監(jiān)測(cè)細(xì)節(jié)耐藥性監(jiān)測(cè)來(lái)源：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)在線2009415南網(wǎng)編輯201076一、需氧菌及兼性厭氧菌的藥物敏感試驗(yàn)一、需氧菌及兼性厭氧菌的藥物敏感試驗(yàn)(一)紙片瓊脂擴(kuò)散法紙片瓊脂擴(kuò)散法紙片瓊脂擴(kuò)散法又稱KirbyBauer試驗(yàn)，是操作最簡(jiǎn)易、使用最廣泛的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。1試驗(yàn)原理將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上。紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散

2、形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度(MIC)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即抑菌圈越大，MIC越小。2培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片(1)培養(yǎng)基：水解酪蛋白(MuellerHinton，MH)培養(yǎng)基是CLSINCCLS采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，pH值為7.2～7.4，對(duì)那些營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球

3、菌等需加入補(bǔ)充物質(zhì)。瓊脂厚度為4mm。配制瓊脂平板當(dāng)天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前應(yīng)將平板置35℃孵育箱孵育，使其表面干燥。(2)抗菌藥物紙片：選擇直徑為6.35mm，吸水量為20ul的專用藥敏紙片用逐片加樣或浸泡方法使每片含量達(dá)到規(guī)定所示。含藥紙片密封儲(chǔ)存2～8℃或20℃無(wú)霜冷凍箱內(nèi)保存，β內(nèi)酰胺類藥敏紙片應(yīng)冷凍儲(chǔ)存，且不超過(guò)l周。使用前將儲(chǔ)存容器移至室溫平衡l～2h，避免開(kāi)啟儲(chǔ)存容器時(shí)產(chǎn)生冷凝水。3細(xì)菌接種細(xì)菌接種采用直接菌

4、落或細(xì)菌液體生長(zhǎng)方法。用0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液濃度。校正濃度后的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種完畢。接種步驟如下：①用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂片接種3次，每次旋轉(zhuǎn)60，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周；②平板置室溫下干燥3～5min，用紙片分離器或無(wú)菌鑷將含藥紙片緊貼于瓊脂表面；③置35℃孵育箱孵育16～18h后閱讀結(jié)果，對(duì)甲氧西林和萬(wàn)古霉素藥敏感試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)孵育24h。4結(jié)果判斷和報(bào)告用精確度為1mm的游標(biāo)卡

5、尺量取抑菌圈直徑(抑菌圈的邊緣應(yīng)是無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的區(qū)域)，當(dāng)葡萄球菌對(duì)苯唑西林的藥敏試驗(yàn)或腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感試驗(yàn)，圍繞紙片周圍只要有極少細(xì)菌生長(zhǎng)提示為耐藥。對(duì)另外一些菌，在抑菌圈內(nèi)散在菌落生長(zhǎng)提示可能是混合培養(yǎng)，必須再分離鑒定及試驗(yàn)，也可能提示為高頻突變株。變形桿菌遷徙生長(zhǎng)使抑菌圈內(nèi)生成的薄層菌可忽略不計(jì)。由于培養(yǎng)基內(nèi)抗藥成分使其對(duì)甲氧芐啶引起的輕微細(xì)菌生長(zhǎng)，生長(zhǎng)層小于20％可忽略不計(jì)。根據(jù)CLSINCCLS標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)量取的抑菌圈直徑

6、判斷病原菌對(duì)該藥物的敏感性形式(敏感中度敏感中介、耐藥)。3如含頭孢克洛，在使用48h之內(nèi)制備平板，使用前應(yīng)在室溫中平穩(wěn)放于孵育箱或?qū)恿髡种?0min以使瓊脂表面干燥。(3)細(xì)菌接種：將0.5麥?zhǔn)媳葷岫染合♂?0倍，以多頭接種器吸取(為1～2ul)接種于瓊脂表面，稀釋的菌液于l5min內(nèi)接種完畢，接種后置35℃孵育16～20h(MRS、VRE孵育時(shí)間需滿24h)，奈瑟菌屬、鏈球菌屬細(xì)菌置于5％C02、幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。(4

7、)結(jié)果判斷：將平板置于暗色、無(wú)反光表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物稀釋度為終點(diǎn)濃度(含甲氧芐啶平板上可見(jiàn)少許散在細(xì)菌生長(zhǎng))。試驗(yàn)菌的結(jié)果報(bào)告可用MIC(ugmg)或用敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)報(bào)告。(三)E)E試驗(yàn)試驗(yàn)E試驗(yàn)(Epsilometertest)是一結(jié)合稀釋法和擴(kuò)散法原理對(duì)細(xì)菌藥敏試驗(yàn)直接定量的技術(shù)。1試驗(yàn)原理E試條是一條5mm50mm的無(wú)孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)稀釋抗生素，

8、另一面有讀數(shù)和判別的刻度?？股氐奶荻瓤筛采w有20個(gè)MIC對(duì)倍稀釋濃度的寬度范圍，其斜率和濃度范圍對(duì)判斷有臨床意義的MIC范圍和分界點(diǎn)值具有較好的關(guān)聯(lián)。將E試條放在細(xì)菌接種過(guò)的瓊脂平板上，經(jīng)孵育過(guò)夜，圍繞試條明顯可見(jiàn)橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條交點(diǎn)的刻度濃度即為抗生素抑制細(xì)菌的特定濃度，又稱抑制濃度(IC)，它與MIC呈高度相關(guān)。2細(xì)茵接種和加樣使用厚度為4mmMH瓊脂平板，用0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊膶?duì)數(shù)期菌液涂布，待瓊脂平板完全干燥，用E試驗(yàn)

9、加樣器或鑷子將試條放在已接種細(xì)菌的平板表面，試條全長(zhǎng)應(yīng)與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。采用CLSlNCCLSAST執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)推薦孵育條件。3結(jié)果判斷和報(bào)告讀取橢圓環(huán)與E試驗(yàn)試條的交界點(diǎn)IC值。E試驗(yàn)IC值與CLSlNCCLS的稀釋法MIC參考值高度相關(guān)，二者直接相對(duì)應(yīng)，CLSlNCCLSMIC折點(diǎn)值適用于E試驗(yàn)。但在判斷結(jié)果時(shí)出現(xiàn)和細(xì)菌、藥物、耐藥機(jī)制和技術(shù)處理有關(guān)判斷問(wèn)題時(shí)應(yīng)予以修正。二、苛養(yǎng)菌的藥物敏感