細(xì)胞凍存培訓(xùn)

1、,細(xì),,胞,,凍,,存,,,目錄,什么是細(xì)胞凍存,細(xì)胞凍存的好處,細(xì)胞凍存的關(guān)鍵因素,細(xì)胞凍存的操作流程,,,一,什么是細(xì)胞凍存,細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的一種方法，是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境（-196℃），以便長期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。,低溫環(huán)境下，細(xì)胞酶的活性降低，新陳代謝減少，細(xì)胞生命活動(dòng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)，從而達(dá)到長期保存細(xì)胞的目的。,,不止有速度，溫度也可跑贏時(shí)間,,,二,細(xì)胞凍存的好處,,細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要細(xì)胞培養(yǎng)人員定期進(jìn)行換液、傳代等操作，

2、此過程需要耗費(fèi)大量培養(yǎng)基、培養(yǎng)瓶等試劑耗材。,不凍存,凍存,處于細(xì)胞凍存狀態(tài)的細(xì)胞不需要進(jìn)行操作。,VS,,細(xì)胞培養(yǎng)操作過程中，由于人為、環(huán)境等因素，會(huì)存在微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。,不凍存,凍存,處于細(xì)胞凍存狀態(tài)的細(xì)胞，污染風(fēng)險(xiǎn)大幅降低。,VS,,細(xì)胞一旦開始體外培養(yǎng)，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。,不凍存,凍存,處于細(xì)胞凍存狀態(tài)的細(xì)胞，生命活動(dòng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)，生物學(xué)特性與凍存前相

3、比不會(huì)發(fā)生變化。,VS,細(xì)胞凍存節(jié)省了大量人力物力。,降低了細(xì)胞種子丟失的風(fēng)險(xiǎn)。,,,三,細(xì)胞凍存的關(guān)鍵因素,,2、冷凍速率,1、保護(hù)劑,,,,,,保護(hù)劑,保護(hù)劑是細(xì)胞凍存時(shí)加入到細(xì)胞中的一種試劑，該試劑的存在能有效保護(hù)細(xì)胞免收凍存過程中產(chǎn)生的冰晶損傷和電解質(zhì)損傷。,形成冰晶，電解質(zhì)濃度的增大是凍存時(shí)細(xì)胞損傷的主要原因。,,根據(jù)是否能穿過細(xì)胞,,滲透性保護(hù)劑,非滲透性保護(hù)劑,一般為小分子物質(zhì)，如甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇

4、、乙酰胺、甲醇等。其原理為：滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液的電解質(zhì)濃度，防止電解質(zhì)損傷。,一般為大分子物質(zhì)聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其原理為：這些大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中的水分子結(jié)合降低自由水含量，從而減少冰晶的形成，同時(shí)分子量大，溶液中的電解質(zhì)濃度也相應(yīng)降低，從而減少了電解質(zhì)損傷。,,,,,,冷凍速率,,緩凍速溶，降溫速率一般在-1~-2℃/min。

5、,溫度下降過程中，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰，細(xì)胞內(nèi)水分外流。若冷凍速率過快，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外流形成冰晶損傷細(xì)胞；若冷凍速率過慢，細(xì)胞嚴(yán)重脫水皺縮，超過一定程度會(huì)失去活性。,一般情況而言，-5℃時(shí)由于有保護(hù)劑存在細(xì)胞內(nèi)外溶液未結(jié)冰；-5~-15℃溶液開始結(jié)冰；-25℃時(shí)細(xì)胞內(nèi)外溶液全部結(jié)冰。-25℃以后可適當(dāng)增加降溫速率。,,,04,細(xì)胞凍存的操作流程,細(xì)胞的凍存應(yīng)在無菌環(huán)境嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行。配制細(xì)胞凍存液并放入4℃預(yù)冷。實(shí)驗(yàn)室常用