圍產(chǎn)期DEHP暴露對(duì)子代大鼠糖代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、2型糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)日益增加，現(xiàn)已成為21世紀(jì)危害人體健康的主要疾病之一。胰島素抵抗和進(jìn)行性的β細(xì)胞功能損害是2型糖尿病的兩個(gè)重要特征；其中胰島β細(xì)胞功能損害是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的必要條件。傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，遺傳、無(wú)節(jié)制的高熱量飲食和久坐不動(dòng)的生活方式的改變是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的主要因素。但是，目前這些因素已經(jīng)不能完全解釋2型糖尿病發(fā)病率持續(xù)增加的現(xiàn)象。最近，越來(lái)越多的研究表明，日常生活中主動(dòng)或被動(dòng)接觸的外源化合物也可以干擾胰腺

2、β細(xì)胞的功能，從而在2型糖尿病發(fā)生的過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。
　　 鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 [Di-(2-ethylhexyl)-phthalate，DEHP]是生產(chǎn)聚氯乙烯（PVC）的一種主要增塑劑，在日常生活中廣泛應(yīng)用。DEHP可通過(guò)消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚接觸等途徑進(jìn)入人體，也可通過(guò)胎盤(pán)和乳汁到達(dá)下一代體內(nèi)。在美國(guó)進(jìn)行的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，75％的被調(diào)查者尿液中可以被檢測(cè)到DEHP及其代謝物。目前已有部分流行

3、病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，DEHP暴露和機(jī)體血糖代謝紊亂存在一定的聯(lián)系。由于胎兒和新生兒對(duì)環(huán)境污染物非常敏感，所以本研究建立了發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期DEHP暴露的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，探討圍產(chǎn)期DEHP暴露對(duì)子代機(jī)體糖代謝的影響，并從胰島β細(xì)胞的發(fā)育、胰島素分泌功能以及凋亡等方面探討其可能的機(jī)制。
　　 第一部分、圍產(chǎn)期DEHP暴露對(duì)子代大鼠糖代謝的影響
　　 目的：探討圍產(chǎn)期DEHP暴露對(duì)子代大鼠生長(zhǎng)發(fā)育和糖代謝的影響。
　　 方法：

4、Wistar雌鼠陰道涂片檢查確定受孕，從受孕 0天開(kāi)始進(jìn)行玉米油和不同劑量的DEHP（1.25和6.25mg/kg/day）灌胃染毒直至仔鼠斷乳（出生后第21天）。測(cè)量孕鼠孕期和泌乳期的體重以及斷乳時(shí)的血糖、胰島素水平的變化。斷乳后每組保留雌雄仔鼠各16只進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)子代生長(zhǎng)過(guò)程中體重、攝食量、血糖、胰島素、葡萄糖耐量和胰島素耐量的變化。同時(shí)分析統(tǒng)計(jì)子代斷乳時(shí)和成年后性腺旁脂肪組織的重量，并觀(guān)察脂肪細(xì)胞的形態(tài)。
　　

5、 結(jié)果：與對(duì)照組相比，圍產(chǎn)期DEHP暴露引起子代出生體重顯著減小；出生后生長(zhǎng)速度明顯減慢。斷乳時(shí)，DEHP暴露組子代出現(xiàn)體脂系數(shù)和脂肪細(xì)胞面積顯著減?。豢崭寡呛涂崭挂葝u素顯著降低。成年后，DEHP暴露組子代雌鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的葡萄糖代謝紊亂，主要表現(xiàn)為高血糖、低胰島素血癥和葡萄糖嚴(yán)重耐受不良；雄鼠空腹血糖與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，但空腹胰島素顯著升高。圍產(chǎn)期DEHP暴露未改變?cè)惺蟮捏w重、血糖和胰島素水平。
　　 結(jié)論：圍產(chǎn)期DEHP暴露

6、引起子代大鼠生長(zhǎng)發(fā)育速度減慢和機(jī)體糖代謝紊亂。
　　 第二部分、圍產(chǎn)期DEHP暴露對(duì)子代大鼠內(nèi)分泌胰腺發(fā)育的影響
　　 目的：通過(guò)圍產(chǎn)期DEHP暴露引起子代大鼠糖代謝紊亂的動(dòng)物模型，探討DEHP暴露對(duì)子代大鼠內(nèi)分泌胰腺的早期影響。
　　 方法：用陰道涂片法檢測(cè)受孕情況，從Wistar大鼠雌性受孕后0天（GD 0）開(kāi)始，對(duì)其進(jìn)行玉米油和不同劑量DEHP（1.25和6.25mg/kg/day）灌胃染毒直至仔鼠出生后第

7、21天斷乳。于PND21處死部分仔鼠，收集胰腺樣本、稱(chēng)重并測(cè)量胰腺組織中胰島素的含量。免疫組化分析β細(xì)胞形態(tài)和質(zhì)量；電鏡觀(guān)察β細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。QPCR分析仔鼠胰腺組織中Pdx-1、insulin、glucagon、Atf4、Atf6、Bip、Ucp2的 mRNA表達(dá)水平；Western Blot分析PDX-1和磷酸化的PERK蛋白含量。
　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組子代斷乳時(shí)β細(xì)胞質(zhì)量和胰腺胰島素含量顯著降低。電鏡結(jié)果提示圍

8、產(chǎn)期DEHP暴露導(dǎo)致斷乳時(shí)子代大鼠β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，主要表現(xiàn)為：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張脫顆粒、線(xiàn)粒體腫脹、完整的分泌顆粒減少、不成熟的分泌顆粒增加。圍產(chǎn)期DEHP暴露還導(dǎo)致子代斷乳時(shí)胰腺組織中Pdx-1、insulin的表達(dá)顯著下降，以及Atf4、ATF6、BiP、Ucp2 mRNA的表達(dá)水平明顯增加；glucagon的表達(dá)水平未受影響。蛋白表達(dá)水平與mRNA的表達(dá)水平意義一致。
　　 結(jié)論：圍產(chǎn)期DEHP暴露導(dǎo)致早期內(nèi)分泌胰腺發(fā)育受損，

9、進(jìn)而引起子代大鼠成年后出現(xiàn)的葡萄糖代謝紊亂。
　　 第三部分、圍產(chǎn)期DEHP暴露導(dǎo)致子代大鼠成年后β細(xì)胞的功能損傷
　　 目的：通過(guò)圍產(chǎn)期DEHP暴露引起子代大鼠糖代謝紊亂的動(dòng)物模型，探討DEHP暴露對(duì)子代成年大鼠內(nèi)分泌胰腺形態(tài)和功能的影響。
　　 方法：將健康受孕Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（玉米油 2 ml/kg/day）、低劑量組（DEHP 1.25mg/kg/day）和高劑量組（DEHP 6.25mg/

10、kg/day）。各實(shí)驗(yàn)組從受孕0天開(kāi)始至產(chǎn)后第21天斷乳（GD0～PND21）持續(xù)灌胃染毒。子代飼養(yǎng)至出生后第27周，收集胰腺組織，稱(chēng)重，測(cè)量胰島素含量。電鏡觀(guān)察β細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)；免疫組化分析β細(xì)胞面積和質(zhì)量。利用葡萄糖刺激的胰島素分泌實(shí)驗(yàn)分析離體培養(yǎng)β細(xì)胞的分泌功能。Western Blot分析胰腺組織中Bax、Bcl-2、Fas、FasL以及casepase-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：圍產(chǎn)期DEHP暴露導(dǎo)致子

11、代雌鼠成年后胰腺β細(xì)胞面積、β細(xì)胞質(zhì)量以及胰腺胰島素含量明顯低于對(duì)照；離體培養(yǎng)的胰島細(xì)胞分泌功能也顯著降低。DEHP組雄鼠β細(xì)胞的面積和質(zhì)量與對(duì)照相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但DEHP組雄鼠單位胰腺胰島素的含量和低糖刺激下胰島細(xì)胞分泌胰島素的能力顯著高于相應(yīng)的對(duì)照組。電鏡結(jié)果證實(shí)DEHP組β細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷隨著年齡的增加，損傷程度不斷加重。值得注意的是，DEHP暴露還導(dǎo)致了子代雌鼠成年后胰腺中凋亡相關(guān)蛋白，如Bax/Bcl-2、Fas、Fas