親代腎血管性高血壓大鼠圍產(chǎn)期給予硫化氫抑制子代大鼠患高血壓的機(jī)制研究.pdf

1、大量的流行病學(xué)資料表明，胚胎期以及胎兒期的環(huán)境因素與出生之后患心血管疾病有直接關(guān)系。早在1953年，Barker提出“胎兒編碼成人疾病”這一假說(shuō)。隨后大量的研究證實(shí)了上述觀點(diǎn)。并且使表觀遺傳學(xué)在環(huán)境相關(guān)疾病中的作用得到了重視。由于表觀遺傳學(xué)的介入，有可能為高血壓的防治提供新的策略。尋找新型的表觀藥物干預(yù)高血壓的發(fā)生發(fā)展，將成為研究熱點(diǎn)。
　　硫化氫（hydrogen sulfide, H2S）是繼一氧化氮、一氧化碳之后的第三種氣體

2、信號(hào)分子。在體內(nèi)合成H2S的酶主要有胱硫醚β-合酶（cystathionineβ-synthase, CBS），胱硫醚γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase, CSE）以及3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST）。血漿H2S水平在高血壓患者體內(nèi)明顯降低。最早H2S作為舒血管物質(zhì)被大家認(rèn)識(shí)，隨后越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，H2S具有多種生物效應(yīng)，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋

3、放，降低交感緊張性等。最近研究還發(fā)現(xiàn)，H2S可以舒張人胎盤血管，改善胎盤血供，降低先兆子癇的發(fā)生。H2S有可能作為新的表觀藥物應(yīng)用于臨床。
　　腎血管性高血壓（renovascular hypertension, RVH）是最常見(jiàn)的繼發(fā)性高血壓。它是以?shī)A閉一側(cè)腎動(dòng)脈造成腎缺血，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system, RAAS）其中血管緊張素II（angioten

4、sin II, Ang II）是RAAS的主要成員。Ang II與血管緊張素II受體1（angiotensin II type1 receptor, AT1R）結(jié)合主要引起血壓升高。AT1R分為AT1a和AT1b，在體內(nèi)廣泛存在。已有研究證實(shí)RAAS的激活參與了多種高血壓的發(fā)病機(jī)制。因此，腎血管性高血壓大鼠被認(rèn)為是研究高血壓發(fā)病機(jī)制的合適模型。原發(fā)性高血壓一般被認(rèn)為有遺傳傾向，但是繼發(fā)性高血壓是否也有遺傳傾向呢，還少有報(bào)道。
　　

5、本課題旨在，以RVH大鼠為模型，采用清醒狀態(tài)下記錄動(dòng)物的心血管參數(shù)，觀察 RVH大鼠子代患高血壓的情況，更接近生理狀態(tài)。應(yīng)用western blot以及DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)，分別從蛋白和基因水平探討其患病機(jī)制。通過(guò)圍產(chǎn)期以及斷奶后給予 H2S觀察其作用及機(jī)制。本課題分為以下三部分：（1）親代腎血管性高血壓大鼠圍產(chǎn)期給予硫化氫對(duì)清醒狀態(tài)下子代大鼠的血壓以及壓力感受性反射的影響；（2）親代腎血管性高血壓大鼠圍產(chǎn)期給予硫化氫對(duì)清醒狀態(tài)下子代大

6、鼠自主神經(jīng)系統(tǒng)的影響；（3）親代腎血管性高血壓大鼠圍產(chǎn)期給予硫化氫是否可以影響子代大鼠AT1b基因的甲基化表達(dá)
　　第一部分：親代腎血管性高血壓大鼠圍產(chǎn)期給予硫化氫可以改善清醒狀態(tài)下子代大鼠的血壓以及壓力感受性反射的敏感性
　　目的：觀察 H2S對(duì)腎血管性高血壓大鼠子代大鼠的血壓，以及壓力感受性反射的敏感性的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1制備腎血管性高血壓大鼠模型
　　7周的SD雌雄大鼠應(yīng)用“

7、兩腎一夾”方法制備腎血管性高血壓大鼠模型。
　　2實(shí)驗(yàn)分為四組：
　　正常SD大鼠子代組（Control），腎血管性高血壓大鼠子代組（F1NF2N），腎血管性高血壓大鼠親代 H2S治療組（F1HF2N），腎血管性高血壓大鼠子代H2S治療組（F1NF2H），其中F1HF2N組親代雌鼠圍產(chǎn)期（懷孕開(kāi)始至哺乳期結(jié)束）每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g，H2S供體）；F1NF2H組孕鼠圍產(chǎn)期不做處理，生產(chǎn)

8、后子鼠5周開(kāi)始，每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g）。
　　3測(cè)量清醒狀態(tài)動(dòng)脈血壓
　　所有子代大鼠從產(chǎn)后8周開(kāi)始，采用鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓系統(tǒng)（DSWY-1，成都儀器廠）測(cè)量清醒狀態(tài)下大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓（systolic blood pressure, SBP），每2周測(cè)一次血壓，至16周。
　　4記錄腎交感神經(jīng)放電
　　腹膜后位暴露腎動(dòng)靜脈，在動(dòng)脈旁區(qū)域分離腎神經(jīng)，記錄腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)。

9、
　　5應(yīng)用我們實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的方法，灌流一側(cè)頸動(dòng)脈竇。
　　6檢測(cè)清醒動(dòng)物壓力感受性反射敏感性
　　制備清醒動(dòng)物動(dòng)靜脈插管，分別記錄血壓和給藥，將插管引導(dǎo)到頸背部皮膚。應(yīng)用Ang II100μg/ml、苯腎上腺素（phenylephrine, PHE）1mg/ml、硝普納（sodium nitroprusside, SNP）2mg/ml，誘導(dǎo)清醒狀態(tài)下壓力感受性反射。
　　7檢測(cè)孤束核（nucleus tractu

10、s solitarius, NTS）蛋白表達(dá)
　　通過(guò)western blot技術(shù)檢測(cè)NTS血管緊張素II受體1（angiotensin II type1 receptor, AT1R）、CBS、以及氧化應(yīng)激、炎癥相關(guān)蛋白NOX4、NLRP3、IL-1β的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1各組子代大鼠清醒血壓的變化
　　1.1雄性子代大鼠清醒血壓的變化
　　從8周到16周齡 F1NF2N組雄性子代大鼠的收縮壓明顯高

11、于 Control組，達(dá)到臨界高血壓的水平，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分別為8周131.9±5.78 vs.113.48±4.08 mmHg；10周133.42±8.08 vs.117.42±5.44 mmHg；12周132.38±4.06 vs.116.76±4.41 mmHg；14周133.63±5.29 vs.112.45±6.45 mmHg；16周135.22±7.08 vs.116.72±4.45 mmHg（P<0.05）。給予Na

12、HS處理后均可以改善上述現(xiàn)象。
　　1.2雌性子代大鼠清醒血壓的變化
　　從8周齡和16周齡 F1NF2N組雌性子代大鼠的收縮壓均高于 Control組，但并未達(dá)到臨界高血壓水平。具體數(shù)值分別為8周123.6±3.05 vs.100.02±11.88 mmHg；10周122.67±1.98 vs.103.28±9.50 mmHg；12周124.58±2.9 vs.105.70±5.45 mmHg；14周119.53±4.77

13、 vs.107.07±6.46 mmHg；16周118.69±4.89 vs.106.95±7.42 mmHg（P<0.05）。給予NaHS處理后均可以改善上述現(xiàn)象。
　　2 H2S對(duì)麻醉狀態(tài)雄性 SD大鼠腎交感神經(jīng)介導(dǎo)的壓力感受性反射的影響
　　頸動(dòng)脈竇急性給予NaHS灌流可以通過(guò)增加壓力感受性反射敏感性，使腎神經(jīng)放電減少，這一作用與頸動(dòng)脈竇區(qū) CSE蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)，而與頸動(dòng)脈竇區(qū)離子通道有關(guān)，開(kāi)放鉀通道，促進(jìn)鉀離子外流，關(guān)

14、閉鈣通道，阻止鈣離子內(nèi)流實(shí)現(xiàn)。
　　3各組子代大鼠壓力感受性反射的變化
　　3.1雄性子代大鼠壓力感受性反射的變化
　　靜脈給予Ang II，與Control組相比，F(xiàn)1NF2N組雄性子代大鼠在8周齡和16周齡壓力感受性反射的敏感性均下降；靜脈給予PHE，在8周齡和16周齡的壓力感受性反射的敏感性均下降，靜脈給予SNP，在8周齡和16周齡的壓力感受性反射的敏感性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.2雌性子代大鼠壓力感受性反射

15、的變化
　　靜脈給予Ang II，與Control組相比，F(xiàn)1NF2N組雌性子代大鼠在8周齡和16周齡的壓力感受性反射的敏感性均下降；靜脈給予 PHE，在16周齡的壓力感受性反射的敏感性下降，靜脈給予SNP，在8周齡和16周齡的壓力感受性反射的敏感性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4各組子代大鼠NTS蛋白水平的變化
　　4.1雄性子代大鼠NTS蛋白水平的變化
　　與Control組相比，F(xiàn)1NF2N組雄性子代大鼠在8周齡和1

16、6周齡NTS AT1R、NLRP3蛋白表達(dá)均增高；16周齡，F(xiàn)1NF2N組NOX4、IL-1β蛋白表達(dá)高于Control組；16周齡F1NF2N組CBS蛋白表達(dá)低于Control組。
　　4.2雌性子代大鼠NTS蛋白水平的變化
　　F1NF2N組雌性子代大鼠8周齡和16周齡的AT1R、NLRP3蛋白表達(dá)高于Control組；NOX4蛋白表達(dá)，各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；16周齡的F1NF2N組IL-1β蛋白表達(dá)高于Control組

17、；16周齡F1NF2N組CBS蛋白表達(dá)高于Control組。
　　小結(jié)：
　　本部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎血管性高血壓大鼠雄性子代血壓升高至臨界高血壓水平，雌性子代大鼠尚處于正常血壓范圍，具有性別差異；雌雄子代大鼠壓力感受性反射的敏感性均下降，可能與NTS AT1R蛋白表達(dá)上調(diào)以及氧化應(yīng)激和炎癥的激活有關(guān)，由于雌激素的保護(hù)作用通過(guò)下調(diào) NTS的NOX4，增加CBS對(duì)抗Ang II引起的損傷作用，這可能就是雌雄子代血壓差異的原因。首先我們

18、發(fā)現(xiàn) H2S可以改善正常麻醉大鼠壓力感受性反射，進(jìn)而降低腎交感神經(jīng)的興奮性。明確了 H2S對(duì)壓力感受性反射的易化作用。在此基礎(chǔ)上，隨后通過(guò)圍產(chǎn)期和斷奶后給予NaHS處理，通過(guò)下調(diào)NTS AT1R的表達(dá)以及抑制下游的氧化應(yīng)激和炎癥的激活，易化子代大鼠壓力感受性反射，降低血壓。
　　第二部分：親代腎血管性高血壓大鼠圍產(chǎn)期給予硫化氫可以改善清醒狀態(tài)下子代大鼠自主神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)
　　目的：觀察 H2S對(duì)腎血管性高血壓大鼠子代大鼠自主

19、神經(jīng)系統(tǒng)的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1制備腎血管性高血壓大鼠模型
　　2實(shí)驗(yàn)分為四組：
　　正常SD大鼠子代組（Control），腎血管性高血壓大鼠子代組（F1NF2N），腎血管性高血壓大鼠親代 H2S治療組（F1HF2N），腎血管性高血壓大鼠子代H2S治療組（F1NF2H），其中F1HF2N組親代雌鼠圍產(chǎn)期（懷孕開(kāi)始至哺乳期結(jié)束）每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g，H

20、2S供體）；F1NF2H組孕鼠圍產(chǎn)期不做處理，生產(chǎn)后子鼠從5周開(kāi)始，每天腹腔注射NaHS(56μmol/Kg，0.2ml/100g)。
　　3檢測(cè)子代大鼠自主神經(jīng)系統(tǒng)功能
　　為了確定子代大鼠自主神經(jīng)系統(tǒng)的功能，選取上述各組8周齡和16周齡的子代大鼠，動(dòng)靜脈置管分別記錄動(dòng)脈血壓和給藥，應(yīng)用文獻(xiàn)描述的方法，分別給予硫酸阿托品（2.5mg/Kg）和普萘洛爾（4mg/Kg）觀察自主神經(jīng)系統(tǒng)的變化。
　　4檢測(cè)延髓腹外側(cè)頭端（

21、rostral ventrolateral medulla, RVLM）蛋白表達(dá)
　　通過(guò)western blot技術(shù)檢測(cè)RVLM AT1R、以及NOX4、NLRP3、IL-1β、CBS蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1各組子代大鼠自主神經(jīng)系統(tǒng)的變化
　　1.1雄性子代大鼠自主神經(jīng)系統(tǒng)的變化
　　8周齡的雄性子代大鼠，與 Control組相比，F(xiàn)1NF2N組交感緊張性增加（49.83±10.52 vs.89.

22、4±10.02bpm P<0.05）；16周齡的雄性子代大鼠，交感緊張性增加（63.25±8.61 vs.83.21±5bpm P<0.05），交感的效應(yīng)也是增加的（41.25±4.78 vs.64.5±5.66bpm P<0.05），給予NaHS處理組均可以改善上述現(xiàn)象。
　　1.2雌性子代大鼠自主神經(jīng)系統(tǒng)的變化
　　各組16周齡的雌性子代大鼠，與Control組相比，F(xiàn)1NF2N組交感的效應(yīng)增加（35.5±3 vs.82

23、.00±5.6bpm P<0.05）。而NaHS處理組，可以改善上述現(xiàn)象。
　　2各組子代大鼠RVLM蛋白水平的變化
　　2.1雄性子代大鼠RVLM蛋白水平的變化
　　與Control組相比，8和16周齡F1NF2N組雄性子代大鼠RVLM AT1R、NOX4蛋白表達(dá)增高；16周齡，F(xiàn)1NF2N組 NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)高于Control組；16周齡F1NF2N組CBS蛋白表達(dá)低于Control組。
　　2

24、.2雌性子代大鼠RVLM蛋白水平的變化
　　8周齡和16周齡的F1NF2N組雌性子代大鼠AT1R、NOX4蛋白表達(dá)高于Control組；16周齡的F1NF2N組NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)高于Control；16周齡F1NF2N組CBS蛋白表達(dá)高于Control組。
　　小結(jié)：
　　本部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎血管性高血壓大鼠子代交感神經(jīng)興奮性增高，迷走神經(jīng)興奮性降低，自主神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡。這可能與RVLM AT1R、NOX4、

25、NLRP3、IL-1β蛋白水平表達(dá)上調(diào)有關(guān)。同時(shí)內(nèi)源性H2S參與了高血壓子代大鼠的自主神經(jīng)系統(tǒng)失衡，雌性子代大鼠通過(guò)上調(diào)內(nèi)源性 H2S的生成對(duì)抗Ang II引起的交感激活，阻止自主神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失衡。
　　第三部分：親代腎血管性高血壓大鼠圍產(chǎn)期給予硫化氫可以改善子代大鼠AT1b基因的甲基化表達(dá)
　　目的：觀察腎血管性高血壓大鼠子代大鼠AT1b基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，并探討其相關(guān)機(jī)制。從基因水平進(jìn)一步明確H2S的作用機(jī)制。

26、>　　方法：
　　1制備腎血管性高血壓大鼠模型
　　2實(shí)驗(yàn)分為四組：
　　正常SD大鼠子代組（Control），腎血管性高血壓大鼠子代組（F1NF2N），腎血管性高血壓大鼠親代 H2S治療組（F1HF2N），腎血管性高血壓大鼠子代H2S治療組（F1NF2H），其中F1HF2N組親代雌鼠圍產(chǎn)期（懷孕開(kāi)始至哺乳期結(jié)束）每天腹腔注射NaHS（56μmol/Kg，0.2ml/100g，H2S供體）；F1NF2H組孕鼠圍產(chǎn)期不做

27、處理，生產(chǎn)后子鼠5周開(kāi)始，每天腹腔注射NaHS56μmol/Kg，0.2ml/100g。
　　3檢測(cè)腎臟蛋白表達(dá)
　　western blot法測(cè)定16周齡各組子代大鼠腎臟AT1R蛋白的表達(dá)。
　　4檢測(cè)腎臟AT1b基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況
　　提取組織DNA，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKits試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行硫酸化修飾，設(shè)計(jì)特異性的PCR引物，以硫酸化修飾好的DNA為模板，應(yīng)用Mast

28、er Mix Reagent Kit，配反應(yīng)體系，放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。構(gòu)建pBLUE-T載體克隆，菌液送到測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　1子代大鼠腎臟 AT1R蛋白水平的變化
　　16周齡的雌雄子代大鼠，雌雄子代 F1NF2N組 AT1R蛋白表達(dá)均高于Control組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2觀察AT1b基因啟動(dòng)子區(qū)NW_047624.110592171–10592486位置的甲基化情況
　　我們

29、觀察 AT1b基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游（ NW_047624.110592171–10592486）15個(gè)CG位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)全部甲基化，各組之間沒(méi)有任何差異。
　　3觀察AT1b基因啟動(dòng)子區(qū)Genbank U01033277–1611位置的甲基化情況
　　我們觀察 AT1b基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游 Genbank U01033277–1611位置7個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化情況。一代測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)起始上游的三個(gè)CG位點(diǎn)甲基化發(fā)生了

30、改變。與對(duì)照相比，腎血管性高血壓子代大鼠甲基化程度降低（66.67％±0 vs.27.78%±25, P<0.05），圍產(chǎn)期以及出生之后給予NaHS均可以增加其甲基化程度。
　　4構(gòu)建 pBLUE--T載體克隆，觀察 AT1b基因啟動(dòng)子區(qū) Genbank U01033277–1611上游的三個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化情況
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組每只動(dòng)物 PCR產(chǎn)物構(gòu)建pBLUE--T載體，挑選10個(gè)克隆子，集中分析上述

31、三個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化情況，與對(duì)照相比，發(fā)現(xiàn)腎血管性高血壓子代大鼠甲基化程度降低（15.33%±6.91 vs.3.89%±3.89, P<0.05），圍產(chǎn)期以及出生之后給予NaHS均可以增加其甲基化程度。
　　小結(jié)：
　　本部分主要研究發(fā)現(xiàn)腎血管性高血壓大鼠子代大鼠腎臟AT1b基因甲基化水平降低，AT1R蛋白水平升高，圍產(chǎn)期以及斷奶后給予NaHS均可以增加AT1b基因甲基化水平，降低AT1R蛋白水平。本部分實(shí)驗(yàn)從基因水平進(jìn)一

32、步明確了腎血管性高血壓大鼠子代血壓升高的具體機(jī)制以及H2S的作用機(jī)制。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)主要研究發(fā)現(xiàn)腎血管性高血壓大鼠雄性子代血壓升高至臨界高血壓水平，雌性子代大鼠血壓雖升高，但尚處于正常血壓范圍。具體機(jī)制如下：1.腎血管性高血壓子代大鼠 AT1b基因甲基化水平降低，使體內(nèi)AT1R蛋白水平升高，進(jìn)而激活其下游的氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，造成壓力感受性反射鈍化，交感系統(tǒng)激活，自主神經(jīng)功能紊亂，導(dǎo)致血壓升高。2.由于雌激素的保