酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa法)

1、酶聯(lián)免疫吸附測定法,生物體系中的化學(xué)測量,裴丹青03081152,復(fù)雜生物體系中生命物質(zhì)的化學(xué)測量是揭示生命奧秘的重要手段，在食品檢驗、疾病診斷和預(yù)防的過程中也日益凸現(xiàn)其重要作用。,經(jīng)典的化學(xué)分析方法（滴定分析、重量分析、簡單的吸光光度法）是以簡單離子或分子為檢測對象的常量或微量分析，面對生物體系成分復(fù)雜且待測物濃度較低的測試條件則往往無能為力。,于是，一系列針對生物體系中化學(xué)成分的測量方法應(yīng)運而生。免疫化學(xué)分析即其重要成員，它將免疫學(xué)

2、知識與化學(xué)分析手段有機結(jié)合，為生命體系中高特異性、超微量的分析提供了解決方法。,什么是 酶聯(lián)免疫分析技術(shù),ELISA的基本原理和方法,ELISA的種類和變化,ELISA的特點,ELISA的應(yīng)用實例,,1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbent

3、assay , ELISA) 。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學(xué)領(lǐng)域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術(shù)( immunoenzymatic techniques ) 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù) 。,,一、基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。,在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體

4、（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）,測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，,再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。,其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微

5、鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。 其方法簡單，方便訊速，特異性強。,二、酶及其底物 酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應(yīng).,ELISA的種類和變化,,（一）雙抗體夾心法（二）間接法（三）競爭法 （四）雙位點一步法（五）捕

6、獲法測IgM抗體（六）應(yīng)用親和素和生物素的ELISA,（一）雙抗體夾心法,此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,獲得待分析物的未標(biāo)定抗體,,將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體,,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),,加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點,洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白,加受檢標(biāo)本（抗原）形成固相抗體－抗原復(fù)合物,洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),加酶標(biāo)抗體生成抗體—待測抗原—酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物,徹底洗滌未結(jié)

7、合的 酶標(biāo)抗體,加底物進行酶催化反應(yīng),根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量測定,,,,,,,,間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。,（二）間接法,包被固相載體: 用已知抗原包被固相載體,,加待檢標(biāo)本: 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì),,加酶標(biāo)抗抗體:與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體,,加底物顯色,根據(jù)顏色

8、反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量測定,,（三）競爭法,此法可用于抗原和半抗原的定量測定，也可用于測定抗體 。,用已知特異性抗體包被固相載體,,,測定管加待測抗原和一定量的酶標(biāo)抗原使二者與固相抗體競爭結(jié)合,對照管只加一定量酶標(biāo)抗原與固相抗體直接結(jié)合,,分別洗滌除去未結(jié)合的成分,,加底物顯色,分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標(biāo)本中待測抗原含量,,對照管由于只加酶標(biāo)抗原，與固相抗體充分結(jié)合，故

9、分解底物顯色深；測定管的顯色程度則隨待測抗原和酶標(biāo)抗原與固相抗體競爭結(jié)合的結(jié)果而異。如待測抗原量多，競爭性地抑制酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合，使固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗原量減少。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。,特點一：靈敏性 該測定法的靈敏度來自作為報告集團的酶。眾所周知, 酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng) ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的

10、所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。 例如，在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平，酶反應(yīng)測定法的敏感度約為5~10μg/ml 。,特點二：特異性 其特異性來自抗體或抗原的選擇性?？乖贵w的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。,例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeA

11、g）和核心抗體（HBcAg），雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。,,ELISA應(yīng)用實例,飼料中鹽酸克倫特羅的測定 飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素， 簡曲霉毒素 ） 飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏菌 ）,甲胺磷殘留分析 甲基對硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析,ELIS

12、A在飼料安全檢測中的應(yīng)用,ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測,河豚毒素,植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素,苯并芘,主要有除草劑與殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（ FN ）、 甲氟磷酸異已酶（ SOMAN ）、 草不綠（ Alachor ）、 西維因（ Carbaryl ）、 多菌靈及克菌丹（ Cap

13、tan ）等。,農(nóng)藥的檢測：,ELISA檢測 “非典型肺炎”冠狀病毒,ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（PtA）33抗體,ELISA在疾病診斷中的作用,ELISA法檢測幽門螺桿菌抗體,ELISA試劑盒商業(yè)資訊,ELISA試劑盒,酶聯(lián)免疫井,DNM-9602G酶標(biāo)分析儀,DNM-9602 標(biāo)配酶標(biāo)分析儀,DNM-9602A酶標(biāo)分析儀,幾種酶標(biāo)分析儀,參考文獻：《生物體