甜葉懸鉤子和明日葉來(lái)源UGT基因的發(fā)掘、克隆及功能鑒定.pdf

1、在植物中很多具有活性的天然產(chǎn)物以糖苷的形式存在，其糖苷化由糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase, GT），主要是UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）催化產(chǎn)生。研究這些酶對(duì)于認(rèn)識(shí)植物中功能性天然產(chǎn)物糖苷的形成和利用有積極意義。相比于傳統(tǒng)的植物提取天然產(chǎn)物的方式，生物合成通常具有高效、安全、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用生物方法合成有價(jià)值的有效成分已經(jīng)成為提高天然產(chǎn)物產(chǎn)量和改善天然產(chǎn)物品質(zhì)的重要途徑。利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方式挖

2、掘關(guān)鍵酶基因，克隆以及在合適的系統(tǒng)中進(jìn)行體外高效表達(dá)，為研究天然產(chǎn)物生物合成提供了重要的平臺(tái)。
　　甜菊糖苷（steviol glycosides）是一類以貝殼杉烯（kaurane）為母核的四環(huán)二萜類糖苷化合物，共同的苷元為甜菊醇（steviol），其中的一些成分具有極高的甜度，尤其是菊科植物甜葉菊中提取的甜葉菊糖苷（stevioside），因其高甜度、低熱量、安全無(wú)毒等特性而作為代糖添加劑廣泛應(yīng)用于食品、飲料等工業(yè)生產(chǎn)中[1-2

3、]，被譽(yù)為繼蔗糖和甜菜糖之后的“世界第三類糖源”[3-4]。甜菊糖苷迄今僅在四個(gè)植物物種中被報(bào)道過(guò)，分別是菊科甜菊屬的甜葉菊（Stevia rebaudiana）和Stevia phlebophyllaA. Gray[5]、薔薇科懸鉤子屬甜葉懸鉤子（Rubus suavissimusS. Lee）[6]以及傘形科當(dāng)歸屬明日葉（Angelica keiskei(Miq.) Koidz.）[7]。本研究選擇甜葉懸鉤子和明日葉兩種植物作為研究

4、對(duì)象，以兩種植物的葉片高通量測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分別從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、酶基因的挖掘與克隆、基因的異源表達(dá)、酶功能測(cè)定等方面研究甜葉懸鉤子和明日葉中涉及貝殼杉烯型四環(huán)二萜化合物生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶。本文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面：
　　1）甜葉懸鉤子（Rubus suavissimusS. Lee），又名甜茶、甜葉覆盆子，屬于薔薇科懸鉤子屬，是廣西特有的野外珍稀天然植物[8-10]。甜葉懸鉤子能生產(chǎn)與甜葉菊中結(jié)構(gòu)類似的貝

5、殼杉烯型四環(huán)二萜糖苷類化合物，但涉及其合成途徑的關(guān)鍵UGT尚不明確。本研究基于甜葉懸鉤子葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)其中注釋的191條推測(cè)UGT基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇部分序列（氨基酸數(shù)250~600）與已知的植物UGT構(gòu)建進(jìn)化樹，篩選出62條可能和甜菊糖苷型化合物合成有關(guān)的具有完整全長(zhǎng)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，成功克隆了其中的40條，將其甜菊醇類底物共同孵育后篩選出具有相應(yīng)底物糖基化活性的UGT六條，其中四條具有類似UGT74G1酶活性，催化甜

6、菊醇母核的19位羧基 O的糖基化，一條具有類似UGT85C2酶活性，催化甜菊醇的13位糖基化，另有一條具有類UGT91D2活性，可能催化steviol-19-O-β-D-glucoside的雙糖基化。研究完成了甜葉懸鉤子中從甜菊醇到甜茶素（rubusoside）合成路徑中兩步糖基化所需的UGT的鑒定。此外，測(cè)定了RsUGT41轉(zhuǎn)化甜菊醇生成steviol-19-O-β-D-glucoside的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　2）明日葉（Ang

7、elica keiskei(Miq.) Koidz.），屬傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物。本研究針對(duì)明日葉葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得151條注釋為UGT序列，對(duì)這些推測(cè)的UGT序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，對(duì)明日葉 UGT（AkUGT）進(jìn)行家族歸類和分組，對(duì)A、D、E、G、H及L六組中的82條UGT序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，臨時(shí)編號(hào)為AkUGT1~82。篩選以上82條序列中具有完整ORF和基因全長(zhǎng)序列23條，對(duì)其進(jìn)行全長(zhǎng)克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建，最終克隆得到

8、序列21條，90％的克隆序列與原cDNA序列匹配度>99%。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主中表達(dá)，表達(dá)粗酶液分別與甜菊醇（steviol）、瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A）、甜菊單糖苷（steviolmonoside）、甜菊雙糖苷（steviolbioside）以及steviol-19-O-β- D-glucoside底物共同孵育，測(cè)定明日葉 UGT轉(zhuǎn)化活性。最終得到兩條與UGT74G1功能相似的AkUGT：AkUGT49和A