埃博霉素異源表達(dá)工程菌株的構(gòu)建及其生物合成產(chǎn)量的研究.pdf

1、埃博霉素(epothilone)是一類(lèi)來(lái)源于纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)具有潛在抗腫瘤活性的16元大環(huán)內(nèi)酯化合物，其作用機(jī)理與紫杉醇(paclitaxel)類(lèi)似，通過(guò)穩(wěn)定微管，阻滯微管解聚，使有絲分裂停留在中期，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。相比于紫杉醇，埃博霉素分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，水溶性更佳，抗腫瘤活性更強(qiáng)。但由于纖維堆囊菌生長(zhǎng)緩慢，易受污染，導(dǎo)致埃博霉素目前價(jià)格高昂，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用，由于缺乏纖維堆囊菌的有效遺傳操作手

2、段，利用其他的原核宿主來(lái)實(shí)現(xiàn)埃博霉素的異源表達(dá)成為了研究的熱點(diǎn)。但埃博霉素的生物合成機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)基因簇為56 Kb之大，GC含量在60％以上，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)埃博霉素基因簇難以進(jìn)行有效的編輯。本實(shí)驗(yàn)室課題組利用Red/ET同源重組技術(shù)構(gòu)建了埃博霉素基因簇的轉(zhuǎn)座載體，并將其導(dǎo)入到伯克氏菌(Burkholderia)DSM7029的基因組中，篩選得到了一株能合成埃博霉素的基因工程菌株伯克氏菌DSM7029∷Tn5-km-epo，編號(hào)

3、為G32。盡管本課題組成功的實(shí)現(xiàn)了埃博霉素的異源表達(dá)，但其產(chǎn)量不高，總產(chǎn)量?jī)H為3.7μg/L。利用有效的遺傳操作方法提高埃博霉素的異源表達(dá)產(chǎn)量成為了當(dāng)務(wù)之急。
　　潛在的埃博霉素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是位于埃博霉素基因簇外圍的orf3與orf14兩個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼的基因，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)Orf3與Orf14可能是埃博霉素的跨膜運(yùn)輸載體蛋白，本研究探究了潛在的埃博霉素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在G32中表達(dá)對(duì)產(chǎn)物中埃博霉素產(chǎn)量變化的影響，通過(guò)

4、Red/ET同源重組技術(shù)構(gòu)建埃博霉素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入基因工程菌株G32中，獲得一株新的基因工程菌株G32∷orf14-orf3，通過(guò)HPLC/MS/MS檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新的工程菌株埃博霉素產(chǎn)量比原始提高了1倍左右，結(jié)果表明，潛在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的異源表達(dá)能有效促進(jìn)伯克氏菌中埃博霉素的生物合成，為實(shí)現(xiàn)埃博霉素異源高效表達(dá)和探究潛在埃博霉素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在埃博霉素次級(jí)代謝過(guò)程中的調(diào)控作用奠定了重要基礎(chǔ)。
　　源自天藍(lán)色鏈霉菌A3(

5、2)的丙酰CoA羧化酶基因（scpccAB基因）能在胞內(nèi)將丙酰CoA羧化合成埃博霉素B、D的重要延伸單元，甲基丙二酰CoA。本文研究了丙酰CoA羧化酶基因G32中表達(dá)對(duì)產(chǎn)物中埃博霉素產(chǎn)量變化的影響，通過(guò)Red/ET同源重組技術(shù)構(gòu)建丙酰CoA羧化酶基因表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入到基因工程菌株G32中，獲得一株新的基因工程菌株G32∷ scpccAB，通過(guò)HPLC/MS/MS檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新的工程菌株埃博霉素B、D的產(chǎn)量比原始提高了4倍左右，埃博

6、霉素B、D所占的產(chǎn)物比例由原來(lái)的20％提高到了40％。結(jié)果表明，丙酰CoA羧化酶基因的異源表達(dá)能有效促進(jìn)伯克氏菌中甲基側(cè)鏈產(chǎn)物(B、D)的生物合成，增大其代謝通量，為實(shí)現(xiàn)埃博霉素異源高效表達(dá)和選擇性生物合成研究奠定了基礎(chǔ)
　　除以上兩個(gè)基因，本研究還從增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)反應(yīng)后修飾等方面，利用Red/ET同源重組技術(shù)構(gòu)建7kb的epoK基因表達(dá)載體，60 kb的自殺型基因打靶載體和70 kb的埃博霉素基因簇與丙酰CoA羧化酶基因轉(zhuǎn)座載體