擬胚體誘導(dǎo)心肌分化及其機理研究.pdf

1、擬胚體(Embryoid bodies，EBs)是一種在形態(tài)學(xué)上與哺乳動物早期的胚胎發(fā)育階段有著很高相似度的一種球狀結(jié)構(gòu)。它是研究早期胚胎發(fā)育過程中各個階段基因的時空表達(dá)和調(diào)控的理想材料。胚胎干細(xì)胞在添加分化抑制物滋養(yǎng)層細(xì)胞或LIF等條件下，可以在體外無限增殖并一直保持其未分化的狀態(tài)，當(dāng)移除以上抑制物后胚胎干細(xì)胞將會逐漸分化。如果這時在體外對胚胎干細(xì)胞或者iPS細(xì)胞進行懸浮培養(yǎng)，其會逐漸形成三維球狀結(jié)構(gòu)即擬胚體。擬胚體能夠在體外分化出類

2、似體內(nèi)的三胚層結(jié)構(gòu)。而心臟又是脊椎動物早期胚胎發(fā)育中可以被率先檢測到的組織之一，因此利用擬胚體法研究心肌分化也是非常有效的方法。懸滴法是經(jīng)典的制備擬胚體的方法，但是因為其操作流程相對繁瑣，而且產(chǎn)生的擬胚體在形態(tài)上不均一，異質(zhì)性比較嚴(yán)重，這就影響了分化過程中的同步性。盡管如此，現(xiàn)如今主要的制備擬胚體的方法還是由懸滴法衍變而來，如通過離心處理來促使胚胎干細(xì)胞形成擬胚體，此方法已經(jīng)被很多學(xué)者所采用。本實驗所探索出的系統(tǒng)與傳統(tǒng)的懸滴法所形成的擬

3、胚體相比無論是在形態(tài)均一性還是分化成功率上都有明顯提高，并且操作流程簡便。該系統(tǒng)非常適合于機械化操作的自動化系統(tǒng)，其同樣適合于以干細(xì)胞為材料的大規(guī)模藥物篩選系統(tǒng)。
　　本實驗中，我們通過小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，經(jīng)過多層次的鑒定:RT-PCR，定量PCR，AP染色，免疫細(xì)胞化學(xué)，擬胚體分化，畸胎瘤，證明了其具備iPS細(xì)胞的全部特征。之后我們以小鼠iPS細(xì)胞及D3小鼠胚胎干細(xì)胞為原始材料，借助本實驗室發(fā)現(xiàn)的一種PCR

4、 Microplate培養(yǎng)板來制備擬胚體，雖然靜止法及離心法都能制備出擬胚體，但離心法制備出的擬胚體形態(tài)均一，同質(zhì)性比較好，又因其凹槽深也去除了Aggrewells培養(yǎng)板的弊端。在擬胚體的制備過程中，也沒有發(fā)現(xiàn)其與D3細(xì)胞形成的擬胚體存在太大的差異。在借助PCR Microplate培養(yǎng)板來制備擬胚體的過程中，我們也對影響擬胚體形成質(zhì)量的幾種因素做了相應(yīng)的探索，如初始密度，離心力。并在之后的試驗中逐步優(yōu)化制備流程，最終產(chǎn)生狀態(tài)理想的擬胚

5、體。然后我們以心肌搏動為指標(biāo)進行了統(tǒng)計分析。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過離心處理的擬胚體心肌搏動比例明顯高于靜止?fàn)顟B(tài)下的。除對產(chǎn)生的擬胚體在形態(tài)上進行了研究之外，我們還對擬胚體的標(biāo)志性基因及干性基因的時空表達(dá)情況通過定量PCR的方法進行了檢測分析。結(jié)果也證明我們所制備的擬胚體狀態(tài)良好。最后我們對影響擬胚體心肌分化的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路采用定量PCR及Western blot的試驗方法進行了相關(guān)的研究，首次發(fā)現(xiàn)離心力在擬胚體誘導(dǎo)心肌分化的早